Western Blot 实验步骤
组织（小鼠十二指肠）蛋白提取
1. 准备: 研磨珠、离心管、生理盐水、RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂，磷酸化蛋白酶抑制剂，移液枪，枪头，手套，冰，涡旋仪，4℃离心机;
在RIPA蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂（根据说明书确定加入量）
2. 研磨: 提前在离心管中分装300μL RIPA蛋白裂解液并放入2颗研磨珠，称取100mg左右样品，置于匀浆机中充分研磨;
3. 蛋白裂解: 将样品置于冰上裂解2h, 期间于涡旋振荡器上震荡2-3次;
4. 蛋白收集: 将裂解后的样品4℃ 12000rpm离心10min，取上清置于新的EP管中备用。
蛋白质浓度检测及制样
1. 准备: BCA蛋白质浓度检测试剂盒(碧云天)，96孔板，生理盐水；
2. 蛋白标准品准备(3个重复)：
完全溶解蛋白标准品，浓度为2 mg/mL(生理盐水稀释)
3. BCA工作液配制：
根据样品数量，试剂A:试剂B=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
4. 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液（生理盐水）补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml;
5. 样品稀释：根据预实验摸索样品的最佳稀释倍数，取稀释后的样品20μL加到96孔板中;
6. 向各孔中加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30min (也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间)。
7. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积及稀释倍数计算出样品的蛋白浓度。
Western Blot
1. 电泳样品准备，每个样品总蛋白上20-40μg，计算各个样品所需取样量，并与5×loading buffer混匀至300μL，沸水煮10 min(使用封口膜封住管口以免爆炸)，放入冰盒中速冷，分装4份，-80℃保存; 剩余的母液可保存于-80℃，以便下次制样;
2. SDS-PAGE凝胶配制(SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒,生工)
a.根据蛋白分子大小，确定制胶浓度浓度。
3. 电泳：
a. 将电泳液倒入电泳槽，玻璃板夹在电泳架上，按照电泳正负极标识对应放入电泳槽内，使电泳液没过胶板下沿，并将胶板内部倒入新配的电泳液，没过胶板上沿，使整个胶板接触电泳液，垂直拔掉梳子防止胶孔破损变形。
b. 点样： 第一块胶的第一个孔点入maker，剩余孔点入10 -20μL样品。快速上样，防止蛋白分子扩散。每个样品的每种蛋白一般做3-4个平行，将大分子量的蛋白与小分子量蛋白可跑同一板胶，相近的蛋白分子量于不同板上跑胶。
c. 对应正负极，盖上盖子并插好电源线，打开电源，设定电压70V，开始电泳约1h后，样品跑到分离胶后加大电压至90-120V，继续电泳，根据不同的目的蛋白分子量，参考maker的位置调整电泳时间。
4. 转膜：
a. 切胶，用切胶板切除浓缩胶，根据maker确定目的蛋白分子量位置切胶，将胶板在电转缓冲液中润湿。
b. 根据滤纸大小裁剪PVDF膜，在甲醇中浸泡5-10min
c. 将海绵和滤纸在电转液中浸透，在电转夹子中按照（黑面，一片海绵，三层滤纸，胶，膜，三层滤纸，一片海绵，白面）的顺序铺平，每放一层用滚子赶走气泡（注意不要使两端滤纸接触造成短路，因而滤纸的大小必须小于PVDF膜的大小），且在整个过程中要防止膜与胶变干。夹好转膜夹，插入电转槽内，侧面放入冰盒，注满电转缓冲液，按正负极标注插入电源，调至180mA并根据目的蛋白的大小设定转膜时间，冰上转膜。
5. 封闭
取出膜，剪裁后按照接触胶面为正面放入孵育盒，用TBST稍洗一次，加入5%脱脂奶粉（1.5g脱脂奶粉+30mlTBST），摇床上封闭2h。
6. 一抗孵育
a. 将脱脂奶粉吸出（切勿触碰到膜），加入TBST清洗一次，根据一抗的稀释比例加入一抗稀释液（牛血清白蛋白）和抗体（注意一定要使膜完全被稀释液浸泡，以防止膜干），摇床孵育30min，4℃静置过夜。
b. 吸出孵育盒中的一抗回收于离心管中，标记抗体名称，回收时间，-20℃保存。
c. TBST洗膜4次，每次在脱色摇床上洗8-10min。
7. 二抗孵育
a. 5%脱脂奶粉和二抗按1:500（4mL+0.8μL）加入孵育盒，没过膜，摇床孵育2h。
b. TBST洗膜4次，每次在脱色摇床上洗10min
8. 显色
等体积混合BeyoECL Star A液和B液，室温放置备用。工作液现配现用。用平头镊子将膜取出，用吸水纸吸去多余液体，切勿接触蛋白面，然后置于保鲜膜上。根据膜的大小，按照每10cm2膜加1mL BeyoECL Star工作液，使工作液均匀覆盖在膜上，放置2-3min，取膜弃去工作液，用吸水纸吸去过多液体，将膜放在两层保鲜膜中间，进行荧光检测。
将膜放入机箱内，设置化学发光，设置连续曝光五张，时间为10s，20s，30s，40s，50s开始拍摄。筛选并调整拍摄的图片，保存。分析试验结果。
