【耀文解读】mRNA篇︱新发现！Exin21序列：提高mRNA产量的助推器

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前言

近日，美国天普大学胡文辉[1]作为通讯作者在《 Molecular Therapy》期刊发表了题为：Protein expression/secretion boost by a novel unique 21-mer cis-regulatory motif (Exin21) via mRNA stabilization 的研究论文。该研究发现一个由21个核苷酸组成的短序列Exin21（CAACCGCGGTTCGCGGCCGCT），其编码一种被称为Qα（QPRFAAA）的短肽。Exin21具有一种神奇的魔力，当它被添加到目标基因的编码区时，可以极大地增加目标蛋白质的产量。

随着生物医药领域的发展，以mRNA和蛋白质为基础的药物，例如mRNA疫苗和抗体，已经大规模进入临床应用，并在COVID-19大流行期间大放异彩。然而，相比于传统药物，这类新型大分子药物制造起来既费时又昂贵，且产量往往不高。因此，如何低成本生产足够数量的mRNA和蛋白质，成为了限制其发展的一大挑战。长期以来，科学家们一直想方设法找到一种可以提高蛋白质产量的普适性方法，例如优化启动子序列，引入增强子元件，密码子优化以及添加Kozak序列、核糖体进入位点（IRES）等等。然而，即使采用了这些策略，一些蛋白质仍然保持低表达水平甚至完全不表达。因此，开发新的、简单的、通用的、能以较低成本显著提高蛋白质产量的方法，特别是在需要大规模生产蛋白质的情况下，仍然是当前的一个研究重点。

Exin21/Qα：mRNA和蛋白质的生产助推器

SARS-CoV-2的研究受到许多病毒蛋白低水平表达的阻碍，因此限制了对COVID-19的研究进展。为了优化SARS-CoV-2病毒蛋白的表达，胡文辉团队将Exin21插入到SARS-CoV-2的包膜蛋白E编码序列和荧光素酶报告基因之间，发现Exin21的插入显著促进了E蛋白的表达和分泌。这种独特的Exin21（CAACCGCGGTTCGCGGCCGCT）编码一种特定的七肽（QPRFAAA），命名为Qα。进一步的研究表明，添加Exin21/Qα可以提高多种SARS-CoV-2结构蛋白（S、M和N）和辅助蛋白（NSP2、NSP16和ORF3）、宿主蛋白（IL-2、IFN-γ、ACE2和NIBP）的产量。此外，Exin21/Qα还可以提高假病毒和标准慢病毒的包装效率，提高了mRNA的合成和稳定性。在人抗SARS单克隆抗体的重链和轻链上添加Exin21/Qα可显著增加抗体的产生。该Exin21/Qα作为一种通用的蛋白质生产助推器，在mRNA和蛋白质为基础的生物制品、药物和疫苗的开发应用中显示出巨大的潜力。

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Exin21/Qα提高mRNA疫苗的产量

添加Exin21/Qα的应用之一就是提高疫苗产量。添加Exin21/Qα使cDNA表达载体中的S蛋白表达增加3∼24倍。如果能够将这种增强应用于大规模疫苗生产，将大大降低成本并加快COVID-19疫苗的供应。研究者假设添加Exin21/Qα还可以促进SARS-CoV-2蛋白的mRNA依赖性翻译，从而提高疫苗接种效率。为了测试这一想法，研究者通过体外转录生成了带有Exin21插入的加帽mRNA，并检查了添加Exin21/Qα是否会在mRNA转染HEK293T细胞中后促进病毒蛋白的产生。研究数据显示，Exin21/Qα的添加以时间和剂量依赖性的方式显著增加了SARS-CoV-2 S蛋白的产生（图2A）。研究进一步发现，这种蛋白质生产促进基序可以普遍适用于其他SARS-CoV-2蛋白的mRNA，包括N，E，ORF3以及宿主蛋白ACE2（图2B、2C）。mRNA疫苗常用N1-甲基假尿苷修饰来提高稳定性并降低先天免疫原性。为了进一步验证Exin21/Qα添加对mRNA疫苗的增强作用，研究者使用N1-甲基假尿苷修饰进行了体外转录。研究发现，与未修饰的mRNA相比，添加Exin21/Qα使修饰的mRNA表现出更强的增强活性（图2D）。这些数据表明，Exin21/Qα的添加可以通过以转录无关的方式促进mRNA稳定性和/或翻译效率来增加mRNA疫苗的产量。

为了进一步确定Exin21/Qα添加是否调节mRNA依赖性翻译，研究者测量了放线菌素D抑制转录后翻译产物的动态变化。通过gdLuc活性测量，发现在没有Exin21/Qα添加的情况下，放线菌素D完全阻断病毒蛋白E（图2E）和ORF3（图2F）的产生。相比之下，尽管有转录抑制（图2E、2F），添加Exin21/Qα通过转录后调节独立于转录起作用。为了进一步确定Exin21添加是否影响靶基因的mRNA稳定性，本研究对E和S病毒蛋白使用了传统的mRNA衰变测定。尽管E和S病毒mRNA在时间过程中表现出不同的变化模式，添加Exin21/Qα使两种病毒E（图2G）和S（图2H）mRNA的半衰期增加了约3∼6倍。

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Exin21/Qα提高mRNA的稳定性

为了更准确地评估Exin21/Qα添加在调节细胞中靶向mRNA动态变化中的作用，本研究通过杂交链式反应（HCR）进行了单分子荧光原位杂交（smFISH）、Click-iT新生mRNA捕获测定和硫醇（SH）连接的烷基化用于代谢测序（SLAM-seq）。HCR 测定鉴定了E-LG mRNA的典型点状信号（由LG探针检测，图3A）。在相同成像条件下平行的比较分析表明，Exin21/Qα的添加以剂量依赖的方式在6h时显著增加了每个细胞的点状信号的数量和强度（图3A）。Click-iT新生mRNA捕获测定（图3Ba）证实，与E-LG组相比，在脉冲1h时Exin97 / Qα添加组（E-QLG）新生E-LG mRNA合成增强了97倍（图3Bb）；在脉冲3h时，E-QLG组增强增加到15468倍，而对照E-LG组增加了935倍（图3Bb）。从脉冲1到3 h，E-QLG组的mRNA合成增加了159倍小于E-LG组的增加（935倍），这可能是由于E-QLG组已经饱和了高mRNA水平（图3Bc）。去除EU（追逐期）后，对照E-LG组的mRNA水平迅速降低；然而，Exin21/Qα的添加使半衰期从0.42小时增加到0.73小时（图3Bb）。SLAM-seq利用新生RNA的s4U标记和IAA烷基化（用于T > C转换）来映射现有单个转录本的RNA合成动力学。实验结果表明Exin21/Qα的添加增加了脉冲期E-LG新生mRNA的合成。在追逐1 h时，两组的T > C率继续增加到约21%（图3Cc），但在追逐2h时，对照E-LG组降至13%，而E-QLG组保持19%（图3C和3D），表明Exin21/Qα的添加增加了E-LG mRNA的稳定性。

这些数据表明，将Exin21 / Qα添加到给定的靶mRNA中可以显著提高mRNA的合成和稳定性，甚至可能提高了翻译效率，从而促进了靶mRNA（例如S蛋白mRNA疫苗）的蛋白质表达和生产。

结语

总之，本研究报告了一种新颖而独特的由21个核苷酸组成的短序列Exin21/Qα，当它被添加到目标基因的编码区时，可以极大地增加目标蛋白质的产量。Exin21/Qα除了可以促进蛋白质生产外，还可以增加mRNA的稳定性。本研究初步发现，由于mRNA合成增加和mRNA衰变减缓，Exin21 / Qα的存在显著增加了靶mRNA的水平。新生mRNA合成的增强通过Click-iT和SLAM-seq技术得到验证。这一革命性的发现也将为RNA生物学和蛋白质领域开辟一条新的研究途径。

参考文献

[1] ZHU Y, SARIBAS A S, LIU J, et al. Protein expression/secretion boost by a novel unique 21-mer cis-regulatory motif (Exin21) via mRNA stabilization [J]. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 2023, 31(4): 1136-58.

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