Leica STELLARIS超分辨激光共聚焦学习视频【翻版，学习培训】

依次打开开关123，但是每个开关之间要间隔10秒钟，打开一，稍微停顿。然后打开2嗯稍微停顿一下，然后打开3，钥匙转向竖直，显示屏下面的这个开关，打开这个卤素灯灯源。四打开卤素灯灯源下面的显微镜控制开关以及电脑的开关。

六然后等待这个显微镜启动以及电脑启动啊，然后现在所有的设备都打开了，打开LASX这个软件，双击。

我们在模胜这个模式下，点击ok让软件启动。软件打开之后呢，点击这个add lezer右边这个三条横杠，点击之后将这个405激光器啊，然后WIL激光器。哦，然后7这次呢开机完成，然后开好机之后呢，我们开始进行放样啊。因为这是个倒置显微镜，所以拨片的话要告知薄的面面调架你的话就正常放置，然后调节要么你夹的大小，然后放好之后。放下提身。那我们先来熟悉一下这个显微镜的触摸屏啊。然后第一个页面呢是主页面，它会显示我们的物镜放大倍数以及一些NA值。然后第二个色彩盘呢啊它会显示这种观察方式，常用的是这个BF明上观察方式，以及这个呃FLorence影场观察荧荧光观察方式。然后第三个界面呢是物镜信息10倍24时以及63倍啊，前3个12 14时是空气净干净头，63倍呢是油镜。呃，它们之间相互做切换的时候呢，比如说我现在从干净切换到油镜的时候，油镜首先会闪烁。当我再次点击油镜的时候，它才会进行切换啊。然后我现在是十倍镜，我切换到10倍镜啊，然后第四个呢XYZ对应的就是我镜头的焦距。当我微微调焦的时候，这个值呢会发生一定的变化啊，当我们关机的时候需要用它将镜头降到最低。长按我们以这个样本为例，如果说我们是组织样本呢，通常是使用空气镜是24时进行观察啊，

那我就可以从十倍镜开始。如果是细胞你想使用油镜的话，一般是从63倍C加镜油找油圈开始啊，那我这是个组成样本，从十倍镜开始找焦点，击十倍镜，然后点击色彩盘选择，然后我染的荧光一个是代替一个FITC，那我选择荧光观察方式啊，点击之后在下面一行呢把SH特ter打开，然后看一下depy是被选择的。选择好我要观察的之后呢，我先切换到这个样本这边，然后我现在感觉是没有光的。如果说你想确认一下，你可以点击FITC，因为它的光的强度会比较强，这时候出来光说明光路是没有问题的那我继续切回到depy界面进行观察

啊，这时候为什么感觉它没有光呢？我可以通过调节这个操作杆移动这个样本的位置，然后我们挪一下。当我距离我的样本有点远的时候呢，你会感觉不到光。当我比较靠近我的样本，我们会发现它会有白色的被激发出来的比较强的光，这说明我的激光照射我的样本上了。这时候我开始准备目镜照焦。这时候呢我在十倍镜下找好了焦啊，可以切换到20倍镜我的最终的拍摄倍数，然后再次找焦。这时候基本上只需要微微调整一下就可以找到胶。然后我可以在这个色彩盘的这个界面把这个shutter关闭掉，或者切换到主界面把这个shutter关闭掉。那我们现在到了软件的这个acquisition界面，呃，首先看一下这个acquisition word是不是XYZ啊，我们也选择XYZ进行常规拍摄啊，然后紧接着看一下接下来的一些参数XY啊他有时候是收起来，我们可以把它展开，然后选择发文章的要求。1024乘1024speed呢一般选择是400，然后zoom factor啊看一下是不是1.0，然后紧接着这个like average我们选择3。This steack呢是拍这个3D层扫的，我们要通过begin和end设置样本厚度，然后来进行拍摄。啊，这里我们只进行常规的2D拍摄啊，不做展示。然后到第二列，我们首先看第一行，它展示的是这个物镜信息。我刚刚选择的是20倍物镜，然后我接下来呢要通过这个小人进这个染料助手带assistant进行荧光染料的设定。比如说我这个样本呢染了这个488和单品，那我可以在这个这个带里面选择我的常用的荒，比如说BAPI选择，然后再选一个488。然后通常选择呢串色比较少的，然后选择一个接收相对多的。如果不想过多纠结呢，那你就选择最后一个选项，点击apply。这时候呢光路就给我们应用上了。但是如果说你在拍摄的过程中发现背景有一点墙，我们可以通过调整这个吸收波长，然后来减少它的背景值。一般来说该地的这个接收范围呢大概调整在470 480左右。然后左边这几个按键呢，我们常用的是fast live。对于fast live来说呢，我们可以点击右边进行设置。初始值呢它默认的是256。这时候呢你预览的这个画面可能会有点粗糙，你可以鼠标左键点住它。然后向右拉设置成512，然后将它关闭。然后右边呢这个对应的是我们拍摄界面，我们为了方便记忆，统一选择这个start，然后来进行拍摄。无论是高级功能还是常规拍摄都可以使用这个按键。接下来我们勾选单个通道啊，白色的框选中它，然后点击fast life。哎，这时候呢没有出现我的荧光信号，那有可能是我的这个参数值比较低，也有可能是我焦急的问题。这时候呢我可以把我的这个变值smart inge适当的向上调整。在我上调的过程中出现了我的荧光信号，这个值的范围呢是不超过100，尽量呢尽量不要超过七八十啊。

如果你到七八十荧光信号还比较弱，可能你更适合于再重新制一次样。然后我们在这个程度上微微调整一下焦，然后这时候呢荧光线的话比较亮，然后我们可以把它值再稍微降低一点点，稍微再降一点点啊，让他不要过爆啊，我们可以适当的欠报一点点，但是一定不要过报。然后这个通道呢我们就设置好了，然后点击stop停止预览，然后切换到第二个通道，白框选中它进行fastlive，这个值呢相对来说会偏暗很多。嗯，那我把它这个smart ain同样的向上调，这时候呢出来一定的荧光信号。我调整我的这个焦距啊，然后我也通可以通过这个上下来调整我的载物台的XY的位置，挪动一下，寻找我要拍摄的区域。假如说到这个区域是比较合适的啊，然后如果说我觉得比较暗，我还可以把这个intensity的值适当向上调一点点，优先调整这个smart gain，然后其次调整intensity啊，稍微调整一点。然后这个intensiity的限制呢就是不超过10。这两个值的增大呢都会增加我的信号，但同样也会增加我的背景值啊，然后调到一个相对比较合适的状态，然后我们点击stop，然后点击。start进行拍摄。这时候两个通道的图呢就扫描完成了啊，如果说我对这个比较强的信号感兴趣，想对它截取放大，我们现在来讲一个不容易出错的方式。然后我首先在这个页面下选择这个强信号所对应的通道绿色通道，然后点击发slive出来预览一张预览图之后，我点击stop。点击完stop之后呢，我将zoom in打开在右边的图上将我的这个目标区域画进去，尽量画成一个正方形，尽量让你的荧光信号处于视野的中央。然后我再次点击fast live，然后立马点停。这次的目的我并不是为了调焦，而是为了看一下我的zone factor值。

比如说我只想放大到3.0，我可以把它从factor修正到3.0，输入3加enter，然后点击star进行拍照。这时候呢，我刚刚勾选的区域呢就被他采集到了。如果想要换一个比较大的视野重新预览，那我们把zoomfactor值恢复成一加一个enter啊，然后第一继续点击fast live，然后调整我这个操作杆的。嗯，旋转它，然后挪到其他合适的视野进行拍照。找到合适的视野之后，点击stop重复上述操作。当我所有的实验结束之后啊，点到acquisition左边的open project，然后将我的project选中，右键save project保存在E盘data，然后对应日期的文件夹里。比如说我这是第三组。然后保存。这时候我的文件夹里就会有一个我对应的这个数据，包含我所有的文件信息啊，一共是十七兆。后续可以在自己的电脑上将图片导出。

关机的时候呢，先关软件，关软件之前先把这个爱的laser后面三个杠里面的激光关掉啊（laser view），棒点成off啊，然后将这个trmple关闭，然后自己的文件save project保存在这个日期的文件夹里，然后保存完了之后软件关闭。软件关闭完了之后呢，你可以拷贝自己的数据，使用光盘拷贝数据。

然后显微镜这边。显微镜这边呢啊如果使用油镜的话，然后要注意清洁镜头。如果没有使用油镜的话，点击第三个物镜的按键，然后切换到10倍镜啊，切换到10倍镜之后，点击第4个XYZ这个按键，然后长按向下这个箭头，

哎，让镜头降到最低。然后关闭显微镜开关，五号开关，关闭卤素灯光源，四号开关，然后关闭机关柜钥匙，三号关开关转向水平，然后关闭。关闭一号开关。啊，如果电脑刻录完成之后，将电脑关闭。等电脑指示灯变成橙色之后，单机完成，然后照上写为，然后登记撤退。