抗癌活性肽对与肿瘤相关成纤维细胞共培养的食管癌细胞增殖影响
摘要：该研究旨在探讨肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖的影响及抗癌生物活性肽(ACBP)对增殖的干预作用和可能的作用机制。收集5例手术切除患者的食管癌组织, 分离培养得到ESCC CAFs并进行特征指标鉴定; 建立CAFs与ESC细胞共培养体系, CFSE染色和流式细胞术检测细胞增殖; 收集CAF-1的条件培养基, 加入ACBP进行联合培养KYSE140细胞, IncuCyte检测细胞增殖; qRT-PCR和Western blot检测Hedgehog信号通路相关基因的表达水平。该研究成功分离CAFs, Western blot结果显示CAFs均表达波形蛋白(Vimentin)及纤维连接蛋白(Fibronectin), 不表达E-钙黏蛋白(E-cadherin); 相比于单独培养, 与CAF-1共培养的KYSE140细胞的CFSE水平降低, 细胞融合率增加(P<0.05), 细胞中的GLI1和PTCH1的mRNA和蛋白水平升高(P<0.05); 相比于条件培养基组, ACBP加入可以使KYSE140细胞的融合率下降(P<0.05); 相较于单独培养, ACBP加入后KYSE140细胞的GLI1和PTCH1的mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)。该研究表明, CAFs可以通过激活Hedgehog信号通路促进食管癌细胞增殖, ACBP可在与CAFs共培养条件下通过抑制Hedgehog信号通路抑制食管癌细胞的生长。
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤, 目前占全球恶性肿瘤死亡率第6位[1]。食管癌在组织学上主要分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)。食管癌目前的治疗措施以外科手术为主, 结合化疗及放射治疗。尽管靶向治疗和免疫治疗等新的治疗方法已取得长足进步, 但食管癌患者的5年生存率依旧徘徊在20%左右[2], 亟待寻找新的更有效的治疗方法改善治疗效果。肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME是癌细胞启动、进展和迁移的利基, 是肿瘤发生、免疫逃逸的关键[3-5]。其中肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是TME的关键成分, 支持癌细胞的增殖和迁移, 同时也保护癌细胞免受抗癌药物的毒性, 其参与包括食管癌在内的癌症的发生、血管生成、增殖、侵袭、转移和复发等生理过程[6-11]。
1980年在果蝇中发现的Hedgehog信号通路, 其是维持组织极性和干细胞数量的关键。Hedgehog信号通路的异常激活存在于各种类型的癌症中[12]。我们前期研究表明, 在癌前病变和食管癌中Hedgehog信号通路的表达被激活[13-14]。抗癌生物活性肽(anticancer biological active peptide, ACBP)是本实验室拥有自主知识产权的一种多肽, 前期研究显示, ACBP在体外和体内对胃癌和结直肠癌等肿瘤细胞具有显著的抑制作用[15-16]。本研究在建立ESCC细胞与原代培养CAFs共培养体系的基础上, 研究ACBP在CAFs存在的条件下是否影响食管癌细胞的增殖以及是否对Hedgehog信号通路产生影响。
1 材料与方法
1.1 细胞与主要试剂
人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE140由内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心实验室保存。PBS、DMEM/F12培养基、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司; Maxima Probe qPCR Master Mix购自Thermo Scientific公司; CFSE Fluorescent Cell Labeling Kit(货号 ab113853)、PTCH1(货号ab53715)、山羊抗兔IgG(货号ab175781)购 自Abcam公 司; TRIzol试剂购自Invitrogen公 司; ImPro-IITM逆转录系统 (货号 A3800) 购自 Promega公司; 兔多克隆抗体E-cadherin(货号20874-1-AP)、Vimentin(货号10366-1-AP)、Fibronectin(货号15613-1-AP)、GAPDH(货号10494-1-AP)购自Proteintech公司; GLI1(货号2534)购自Cell Signaling公司; 微量总蛋白提取试剂盒购自Invent Biotechnologies公司; BCA蛋白质分析试剂盒购自北京索拉比奥科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的分离与培养
本研究方案经内蒙古医科大学伦理委员会审核通过(编号: 2013026), 收集内蒙古医科大学附属医院手术患者的食管癌组织(所有患者均签订知情同意书)。将组织置于含有1%青霉素/链霉素双抗PBS中冲洗3次并用剪刀将其切碎成直径1 mm的组织块, 然后将其放入100 mm培养皿中并干燥以使其附着于培养皿上, 加入6 mL含有20% FBS的DMEM/F12培养基, 于37 °C、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。成纤维细胞在4或5天后从组织中生长出来。收集CAFs以备后续实验。实验中所用CAFs均在第6代以内。
常规培养CAFs, 当细胞汇合度达到80%, 弃去培养基, PBS清洗后加入无血清DMEM/F12培养基, 培养48 h后收集细胞培养液, 1 000 r/min离心5 min, 收集上清液作为CAFs条件培养基, 保存于–80 °C备用。
1.2.2 细胞培养 将食管癌细胞KYSE140于含有10% FBS的RPMI 1640培养基, 37°C、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。按CFSE Fluorescent Cell Labeling Kit厂家说明书将KYSE140用CFSE染色后, 再将其与CAFs通过Transwell共培养, 35 μg/mL ACBP处理48 h, 收集细胞进行流式细胞术检测。
1.2.3 ACBP对共培养条件下食管癌细胞KYSE140增殖的影响 将KYSE140细胞以5×103个/孔接种于96孔板中, 常规培养24 h后加入CAFs条件培养基, 设ACBP处理组、ACBP联合CAFs条件培养基处理组、CAFs条件培养基组、空白对照组, 每组至少设3个重复孔, 培养72 h, 使用IncuCyte® S3活细胞分析系统监测和分析细胞生长。实验重复3次。
1.2.4 荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 用TRIzol试剂和ImPro-IITM逆转录酶制备总RNA和cDNA第一链。用于检测PTCH1、GLI1和GAPDH的引物和探针序列见表1。用2–ΔΔCt法分析目的基因表达水平, 以GAPDH为内参。
1.2.5 Western blot 使用动物培养细胞和组织的微量总蛋白提取试剂盒获取细胞总蛋白。使用BCA蛋白质分析试剂盒对蛋白质进行定量。总蛋白(30 μg)在100 °C下加热5 min, 进行SDS-PAGE电泳, 转膜至PVDF膜上。在5%牛奶(w/V)的TBS-T中室温封闭2 h, 分别与5%牛奶TBS-T中的一抗(稀释比例均为1׃500) E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、GLI1和PTCH1在4 °C孵育过夜。以Alexa Fluor 790标记的山羊抗兔IgG为二抗(稀释比例为1׃10 000)。使用红外成像系统(奥德赛LI-COR)采集荧光信号。以GAPDH为内参, 结果使用ImageJ软件进行分析。
1.2.6 数据分析 所有实验数据显示为3个独立实验的均数±标准差(x_±s)。所有统计分析均采用SPSS 13.0统计软件。t检验用于两组之间的比较。采用单因素方差分析和Tukey检验进行多重比较, 以确定多组的统计显著性。P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 肿瘤相关成纤维细胞的培养与鉴定ESCC组织培养4~5天后, 显微镜下显示贴壁的ESCC组织块周围有细胞长出。从5个ESCC标本中分离培养了5个ESCC CAFs(图1A, 结果展示2个CAFs), 传代后细胞形态均呈长梭形成纤维样细胞。在分离的CAFs中通过Western blot检测上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)以及间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达。5个CAFs均显著表达Vimentin, 表达Fibronectin, 不表达E-cadherin(图1B), 说明我们成功分离ESCC CAFs, 并且其中未混有上皮细胞。
2.2 ESCC CAFs对共培养条件下ESCC细胞增殖的影响
为了探讨 ESCC CAFs是否能促进 ESCC细胞KYSE140的增殖, 我们用CFSE染色KYSE140细胞, 单独培养或通过Transwell与1号CAF(CAF-1)共培养,然后采用流式细胞仪分析荧光强度。我们发现, 与CAF-1共培养的KYSE140细胞的CFSE荧光强度较低, 表明与CAF-1共培养的KYSE140细胞比单独培养的条件下有更多的增殖细胞(图2)。
将CAF-1收集的条件培养基与KYSE140细胞共培养。结果显示, 培养72 h, 在CAF-1条件培养基中培养的KYSE140细胞的融合率高于对照组(图3)。这说明与ESCC CAF-1联合培养KYSE140具有更高的增殖活性, ESCC CAF-1可以促进ESCC细胞的增殖。
2.3 ESCC CAFs对共培养条件下KYSE140细胞Hedgehog信号通路的影响
为了明确 CAF-1是否通过激活 Hedgehog信号通路促进 KYSE140细胞增殖 , 我们使用Transwell将KYSE140细胞与CAF-1共培养, 与单独培养KYSE140细胞相比, 与CAF-1共培养的KYSE140细胞中可检测到PTCH1和GLI1的mRNA表达水平显著增加(PTCH1: P=0.016 5; GLI1: P=0.012 9)(图4A)。Western blot检测显示, CAF-1作用后PTCH1和GLI1的蛋白相对表达量较对照组明显上调(PTCH1: P=0.000; GLI1: P=0.005), 差异具有显著性(图4B和图4C), 说明共培养条件下ESCC来源CAFs通过激活Hedgehog信号通路促进了KYSE140细胞增殖。
2.4 ACBP对共培养条件下KYSE140细胞增殖的影响
如图5所示, 与对照组相比, ACBP作用48 h后KYSE140细胞中的CFSE水平显著升高, 说明ACBP对KYSE140细胞的增殖具有明显的抑制作用; 在与CAF-1共培养体系中, ACBP对KYSE140细胞的增殖具有一定的抑制增殖作用 。
2.5 ACBP对共培养条件下KYSE140细胞中Hedgehog信号通路的影响
为了研究ACBP是否影响KYSE140细胞的Hedge-hog信号通路, 通过qRT-PCR结果显示, 与对照组相比, ACBP可以下调KYSE140细胞中PTCH1 (P=0.005 1)和GLI1(P=0.026 8)的mRNA水平(图6A); Western blot检测结果显示, ACBP单独作用后, KYSE140细胞的PTCH1(P=0.000)和GLI1(P=0.001)的蛋白相对表达量较对照组明显下降, 差异具有统计学意义(P<0.05)(图6B和图6C)。在共培养条件下, ACBP作用可以抑制细胞的PTCH1和GLI1蛋白表达(P<0.01), 差异具有统计学意义。
3 讨论
肿瘤微环境中含有多种成分, 包括CAFs、免疫细胞、内皮细胞、神经元、脂肪细胞和细胞外基质等, 其中CAFs被认为参与了包括食管癌发展在内的所有过程。CAFs分泌多种因子, 包括生长因子、趋化因子和细胞因子来调节肿瘤和TME中的其他成分。如ESCC来源的CAFs分泌的IL-6不仅支持肿瘤细胞生长, 而且促进成纤维细胞活化[17], 调节肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)及其在肿瘤免疫抑制中的作用[18], 同时促进肿瘤细胞和巨噬细胞的迁移[19]。CAFs对IL-6的表达上调了STAT3/NF-κB对CXCR7的表达, 在化疗耐药中起着重要作用[20]。CAFs可以通过分泌TGFβ1[21]和PAI-1[22], 高表达CXCL1[23], 从而提高食管癌的放化疗抵抗。另外, CAFs能够促进食管鳞状细胞癌淋巴结转移[24]。研究显示, 在ESCC CAFs的裂解液、条件培养基和外泌体中都有SHH(Sonic Hedgehog)的高表达, 而且CAFs可以促进食管癌细胞株的增殖和迁移[25]。但是CAFs对ESCC细胞株本身的Hedgehog信号通路的影响鲜有报道。本文首先研究了CAFs对食管癌细胞增殖的影响, 研究结果显示, 食管癌细胞KYSE140 在与CAFs共培养条件下或者CAFs条件培养基中的增殖速度均高于单独培养KYSE140组, 说明CAFs能够促进食管癌细胞KYSE140的增殖。
Hedgehog信号通路最初在果蝇中被发现, 是一种进化上保守的信号机制, 在胚胎发生、生长和模式形成中起着重要作用。该通路的重要组成部分包括Hedgehog配体[包括SHH、IHH(indian Hedgehog)和DHH(desert Hedgehog)]、Patched受体(PTCH1和PTCH2)、融合抑制因子(suppressor of fused, SuFu)和GLI转录因子(包 括GLI1、GLI2和GLI3)。在大多数研究中, SHH与PTCH1的结合导致SMO的去表达, 从而激活SHH信号, 导致GLI1向细胞核的移位[26-27]。核GLI1可以调节包括PTCH1和Gli1在 内的许多基因的表达。我们对共培养条件下CAFs对KYSE140细胞的Hedgehog信号通路标志进行检测, 结果显示, CAFs上调KYSE140细胞中PTCH1和GLI1的mRNA和蛋白水平, 说明CAFs能够激活食管癌细胞KYSE140的Hedgehog信号通路, 并且CAFs可能参与对KYSE140细胞的促增殖作用。
ACBP是本实验室从山羊脏器中分离得到的一种多肽[28]。前期研究表明, ACBP通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)诱导细胞凋亡, 从而在体内外抑制胃癌细胞和胃癌干细胞的增殖[15-16]; 在结直肠癌模型中, ACBP通过调节PARP-p53-Mcl-1信号通路, 抑制结直肠癌细胞生长, 诱导细胞凋亡[29]。此外, ACBP与顺铂联合应用, 能够发挥减毒增敏的作用, 提高荷瘤小鼠的生活质量[15]。在我们的研究中, ACBP单独培养食管癌细胞KYSE140可以抑制其增殖, 由于CAFs通过激活Hedgehog信号通路促进KYSE140增殖, 我们研究了ACBP是否也干预Hedgehog信号通路, 发现ACBP单独作用KYSE140可以降低细胞的 PTCH1和GLI1的转录和蛋白水平。在与CAFs共培养条件下, ACBP同样可以抑制PTCH1和GLI1的蛋白水平, 具有抑制Hedgehog信号通路的作用, 说明ACBP可以通过调节Hedgehog信号通路干预CAFs对食管癌细胞的增殖的促进作用。
综上所述, 本研究发现从食管癌组织中分离的CAFs可以通过Hedgehog信号通路的激活促进食管癌细胞的增殖, ACBP可以抑制食管癌细胞的增殖, 并通过抑制Hedgehog信号通路来干预CAFs对共培条件下食管癌细胞增殖的促进作用。这些结果为我们理解ACBP的抗癌活性的分子机制提供了新的见解, 也将为ACBP作为生物活性剂参与治疗食管癌提供参考依据。
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