荧光定量PCR技术-相对定量数据如何分析

Q：如何判断Ct值是否有效？

分为五部分：

一：选取对照

二：选取合适内参

三：判读图谱

四、扩增效率

一：选取对照

NTC：即空白对照。用水代替模板（阴性对照）

作用：排除体系自身污染

NRT：RNA对照 --No RT Control ,即 以不加逆转录酶 做逆转录PCR的产物为模板

作用：排除基因组自身污染

***若△ct值（NCT-target）≥5 ，则普遍认为数据可信

二：选取合适内参

三：判读图谱 ---6小点

1.矫正染料ROX

ROX为惰性染料，不会跟随PCR反应过程发生变化

作用：校正加样误差

2.扩增曲线

分为4个阶段：基线期、指数增长期、线型增长期、平台期。

小Q：为什么同样的复孔，会有不同的平台期，即平台期分散？

A：平台期的高低并不是QPCR的主要关注点，判定实验结果好坏的指标应为扩增效率是否在可接受的范围内。我们应该只关注指数扩增区域，如下图（48个样的重复率肉眼可见的是高的），因为它是符合核心方程的（...）

因素：1.初始模板投入量的偏差 2.产物的积累，样品的消耗等产生的影响

3：基线

小Q：为什么会有基线期？

A：在PCR初始阶段，模板量少。其待测基因积累数量达不到响应程度时，机器无法去读取稳定的荧光信号的变化。而且受各种因素影响（如机器本身检测情况、反应体系等。。。），机器需要这么一个基线期对背景时期进行归一化处理。

在正常情况下，基线时期与X轴相平

***若遇到下面情况，即基线期不符合实际的检测过程

这个不慌，可调试。

在分析设置菜单中，找到基线循环期的初始循环数和末尾循环数

如图：

我们可以将末尾循环数降低----可以调回来正常图谱

（如果基线期是先平行后翘起来的情况，则可以将末尾循环数往高了改（将起峰的那个位置设置为末尾循环数））

4、阈值线

阈值线在靠近X轴，刚起峰的位置

仪器默认阈值：在基线时期荧光定量信号的标准偏差的10倍处

如下图红线，只要阈值线在“坡度“”曲线里的“偏直线”处的中间范围内，是可信的。

5、Ct值

Ct值：阈值线与扩增曲线的交点。指扩增荧光信号到达阈值时所经历的循环数

（待测基因表达量越高，其达到阈值时经历的循环数越少，即Ct值越小）

***复孔间的Ct值STD<0.2

6、熔解曲线

Tm值：指双链DNA分子解链一半时的温度

根据峰值是否单一来判断图谱是否可信

四、扩增效率

计算斜率。

扩增效率应符合近似值（MIQE）：90%-110%

Q:如何处理相对定量数据？

在跑完定量PCR后。数据检测看：

基线是否正常；ROX校正是否正常；Ct值；复孔重复性

后续进行数据计算