纳米颗粒制剂疫苗:机遇与挑战

摘要：疫苗利用免疫系统的固有特性来预防疾病或治疗现有疾病。人们一直致力于从机制上理解免疫系统是如何运作的，并致力于设计高效有效的疫苗。近年来纳米技术的进步为应对免疫学和疫苗开发方面的严峻挑战提供了独特的机会。首先，纳米颗粒体系为研究免疫系统的运行提供了理想的模型系统，使系统地识别关键因素并了解其在特异性免疫反应中的作用成为可能。此外，纳米颗粒系统的多用途组成/结构使开发高效疫苗的新策略/新平台成为可能。在这篇综述中，我们通过疫苗免疫机制的框架，讨论了纳米颗粒的优势和在疫苗开发中面临的挑战。

前言

几十年来，免疫学、分子遗传学和纳米技术的进展使疫苗研究发生了革命性变化。从交叉中和流感疫苗1的实验演示到癌症疫苗治疗的临床转化，纳米颗粒(NP)疫苗一直处于这些创新的前沿。（开题报告讲解）纳米疫苗是那些具有颗粒状形态和大小范围从几纳米到几百纳米的疫苗。它们在疫苗接种方面具有巨大的潜力，因为它们可以通过尺寸、形状、表面修饰等参数方便地定制成类似于免疫系统中的自然靶点，以优化生物分布和与免疫细胞的相互作用。纳米疫苗的材料方面已经在最近的文章中进行了全面的综述。5-7然而，随着发表的关于纳米颗粒疫苗的研究成果的积累，很明显，共同的机制支撑着纳米颗粒配方所显示的优势。这些机制是保存在整个物质系统中，并与免疫系统的基本工作紧密相连。理解交互的这些特定特性纳米颗粒和免疫系统之间的差异可能会为改进疫苗设计带来独特的机会。

本综述的目的是巩固与疫苗接种有关的免疫机制的现有信息，这些信息往往分散在免疫学的广大和已建立的领域。

我们将从免疫和疫苗接种的生物学方面的基本讨论开始，强调基于纳米颗粒的研究对免疫学研究领域的贡献，以便了解纳米颗粒和免疫系统之间的联系。我们关注涉及树突状细胞的主要途径(其他途径，如巨噬细胞介导的等，不在本综述的范围内)，并进一步阐述显著的NP疫苗演示是如何通过利用已知的有益相互作用实现卓越疗效的。最后，我们强调了当前纳米颗粒制剂疫苗所面临的挑战，并提出了未来纳米颗粒制剂疫苗发展的方向。

简单介绍免疫反应（基础知识）

免疫系统由一组细胞和可溶性成分组成(表1)。它负责维持体内平衡8并对任何物质进行防御检测到异常。这些异常可能是被病原体感染，9,10癌细胞的出现，11或误解正常信号导致自身免疫检测到异常。同时，病原体及其引起的相关损伤被树突状细胞(DCs)检测到，树突状细胞对病原体进行取样并迁移到淋巴结。在那里，树突状细胞向T细胞提供抗原，导致T细胞的激活，T细胞作为免疫反应的中心协调者，对病原体或细胞毒细胞消除病原体感染的自身细胞。扩散或由树突状细胞携带到淋巴结的同源病原体抗原被B细胞识别，刺激抗体的产生。这些抗体通过结合中和病原体毒性并增强细胞吞噬能力。先天免疫功能和适应性免疫功能共同作用于病原体的清除和感染的解决。

从基于纳米颗粒的模型系统学习:对免疫系统的高级理解

传统的免疫学知识是建立在基于小分子工具的体外和体内实验之上的。较好的例子包括用分离的细胞因子或病原体成分进行免疫细胞活化的研究。利用基于纳米颗粒的模型系统对免疫系统的研究在不止一个方面促进了我们的理解。与小分子不同，纳米粒子的体积和表面积使其具备多种功能，其作用不再局限于生物化学领域。同样的特征也使它们能够模拟自然病原体的形态和一些物理/化学性质;然后，这些参数可以受控地进行调整，以便各自对免疫系统功能的影响可以独立研究。

为了了解各种免疫反应的途径，纳米颗粒通常被用作病原体关键成分的载体系统。人们很快意识到，纳米颗粒载体和免疫细胞之间的物理和化学相互作用决定了免疫反应的结果。抗原的重复排列是病原体表面的自然特征，它比随机聚集的抗原更能刺激B细胞的反应。Kanekiyo等人使用自组装的蛋白质纳米颗粒以八面体对称排列流感HA抗原，证明了定义的对称也是刺激B细胞产生抗体的一个重要因素1(图1a)，这引起了人们的兴趣病毒的几何特征如何在免疫细胞刺激中发挥作用的问题。（开题报告讲解）

在具有确定对称性和密度的纳米颗粒上装载病原体相关特征表明，对免疫细胞的最佳刺激有一个几何要求。另一个例子表明，单分子CpG分子佐剂需要在纳米颗粒表面呈现以达到最佳效果。Gungor等人证明将CpG配体组装成纳米环进一步增强了佐剂效果26(图1b)。这些结果表明，当免疫细胞在初始阶段与病原体通信时，配体和受体微域之间可能存在空间/几何关系。

使用预定义大小的纳米颗粒进行淋巴转运的研究，丰富了我们对不同生物实体如何进入适应性免疫室并与之相互作用的理解。27-30 Reddy等人。首次演示了粒径优先的淋巴管转运，使用聚丙烯硫化物(PPS)为基础的纳米颗粒，粒径分别为25、40和100纳米。通过将这一发现应用于疫苗应用，他们进一步证明，在小鼠模型中，25 nm而不是100 nm的PPS纳米颗粒有效地引流到淋巴结将转化为更强的B细胞反应。（开题报告讲解）

基于工程纳米粒子的人工抗原呈递细胞(aAPCs)最近成为一种重要的模型系统，用于理解树突状细胞和T细胞之间的通信。基于颗粒的aAPCs的构建通常包括在纳米颗粒表面装饰DC膜蛋白，如表位结合的主要组织相容性复合体(MHC)分子和共刺激配体，这些蛋白参与DC和T细胞之间的信号传递。人们发展了各种生物偶联技术，将蛋白质与纳米颗粒表面进行化学连接。与自由溶解的配体相比，这些信号分子在纳米颗粒表面的呈现允许在更接近于天然配体的条件下与T细胞相互作用，因为T细胞上的信号受体聚集在亚微米大小的区域44 - 46。这些细胞系允许对外周血细胞毒性T细胞(CTL)进行定制的和可复制的激活，但由于生物安全方面的考虑，如可能对外来细胞系产生严重的免疫反应，这些细胞系仅限于体外应用。基于合成粒子的aapc避免了这些生物危害，同时保持灵活性，为T细胞相互作用提供一组预定义的信号分子。因此，它们已被用于研究T细胞在体外和体内的活化。基于颗粒的aAPCs已被应用于T细胞相互作用的生物物理要求的体外研究利用PLGA微粒，Sunshine和同事研究了MHC和共刺激分子在球形和椭球粒子上的呈现。他们观察到T细胞和两种粒子之间的相互作用截面是不同的，这导致了T细胞的不同激活。依赖于T细胞和APCs之间相互作用截面的面积或几何形状，以获得最佳的T细胞激活。在另一个新的应用中，Santamaria和同事设计了表面装饰由MHC分子与自身抗原肽复合组成的氧化铁纳米颗粒，以模仿免疫抑制树突状细胞。颗粒表面mhc -肽复合物的密度是控制Treg.51刺激的关键。

疫苗及其类别的定义

疫苗利用免疫系统的固有特性产生保护和治疗作用。疫苗配方的基本成分是抗原和佐剂。它们分别为适应性免疫系统提供致病因子的身份，以便进行特定的反应，并提供关于疾病性质的信息，以便指导有效的免疫反应。抗原主要是用于T细胞反应的蛋白质(但它们可以采取不同的形式，如多糖、核酸或一些合成材料，用于B细胞反应)。佐剂可以是免疫原性小分子，分子遗传工具，如mrna或sirna，或特殊设计的合成材料，如纳米颗粒。疫苗的目的是提供树突细胞,充当适应性反应的引发剂,用适当的特异抗原和佐剂发起正确极化所需辅助T细胞反应,并产生所需的套互补的效应细胞,如细胞毒性T细胞和B细胞。

图2说明了对不同疾病的保护相关物的要求一些病毒和细菌只需要疫苗来诱发保护性水平的抗体(产生)B细胞)对表面蛋白质或分泌的毒素提供保护。例如人类乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、白喉和肺炎球菌。另一些则需要诱导CD4+或细胞毒性T细胞(CD8+)反应来预防感染。CD4+ T辅助细胞协调先天和适应性系统对抗疾病因子的作用，CD8+细胞毒T细胞消除感染/突变细胞。对于癌症，CD4+和细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的反应相结合是有效的需要。

图2不同疾病对防护相关物的要求。人乳头状瘤病毒:人乳头瘤病毒;HAV:甲型肝炎病毒;乙型肝炎:乙型肝炎病毒;西尼罗河病毒;MRSA:多重耐药金黄色葡萄球菌。

疫苗分为两类:预防疫苗和治疗疫苗。预防性接种，又称保护性接种，是指针对常见病原体的疫苗。它是基于对疾病病原体诱导的免疫记忆(由特定抗原介导)和记忆细胞在随后接触相关病原体时迅速反应的能力。不出所料，整个减毒活病原体包含了所有抗原和自然佐剂，这些抗原和佐剂都是诱导强效应答所必需的，所以它们已经成为疫苗开发的一个有效平台。最显著的例子是全减毒黄热病疫苗YF-17D，已知仅通过一次接种就可对黄热病产生终生保护。然而，并不是所有的病原体都可以作为活疫苗使用。有些病毒毒性太大，而另一些病毒天生就无法免疫。23,58这些情况需要将抗原传递到原病原体之外的策略。抗原可以从病原体培养物中纯化，也可以通过基因重组产生。另外,抗原肽的形式提供,可以提供的MHC molecules59或者他们可以采取遗传物质的形式(如DNA和RNA),可以翻译回本地蛋白质形式使用内在的细胞内蛋白表达机械body.60, 61。这些抗原与外部佐剂配合使用时称为亚单位疫苗纳米颗粒被发现是亚单位疫苗的优良载体系统，在许多情况下，它们可以同时提供佐剂效果。这些特征使得纳米颗粒配方疫苗在开发新一代保护性疫苗时非常有吸引力。

相比之下，治疗性疫苗的目的是通过使用疫苗的基本配方，即抗原和佐剂的组合，恢复免疫系统的稳态，以激发对各种慢性疾病的治疗效果，如癌症和自身免疫疾病，其中免疫反应的失败是一个根本原因。癌症免疫疗法包括激活免疫系统预防癌症发展和/或治疗癌症发展。理想情况下，免疫细胞可以对特定的肿瘤细胞进行靶向攻击，而不会对正常组织造成损伤。通过这种方法，可以解决由转移引起的原发和继发肿瘤。癌症疫苗属于癌症免疫治疗大家族，其中还包括治疗性单克隆抗体63种重组细胞因子，64种免疫检查点抑制剂，65种过继细胞治疗。癌症疫苗方法相对容易实施，这意味着它作为一种利用免疫系统进行癌症治疗的有吸引力的方法脱颖而出。与化疗和放疗等常规治疗方法相比，癌症疫苗的其他好处是其低毒性和高特异性。目前癌症疫苗的发展主要集中在提供个性化抗原的策略，以及改进运载工具和佐剂配方;后两者的发展情况与保护性疫苗领域的情况非常相似。在许多自身免疫性疾病中，Treg损伤是一个常见的主题。在许多相关动物模型中，Treg功能的重建被观察到可以改善预后目前，自身免疫疾病的治疗选择仅限于非特异性免疫抑制剂，增加了感染或癌症的风险。诱导疾病特异性Treg抑制自身免疫的治疗性疫苗的发展可能会彻底改变自身免疫疾病的治疗。通过免疫诱导耐受一直被认为是有可能的，因为过量免疫抗原的动物会导致抗原特异性的免疫耐受而不是耐药性。在过量的情况下，胸腺组织可能获得并随后呈递注射的抗原诱导Treg。这通常被认为是这一现象背后的机制。然而，由于明显的安全性和实用性，过量条件下的免疫不适合临床应用。另一种方法利用皮肤朗格汉斯细胞的耐受性诱导免疫耐受性。66,69这包括将mhc限制的自身抗原多肽注射到朗格汉斯细胞所在的真皮层，但在临床试验中随机触发的自身免疫表明，这些真皮APCs可能采用非耐候性表型，使该策略不太可靠。

70 .获得治疗性免疫疾病疫苗的几种方法，包括纳米颗粒配方疫苗，正在积极发展中从本质上讲，纳米颗粒能够同时携带多种类型的货物，从而允许免疫抑制药物的联合传递，从而可靠地确保耐生APC特征。为此，自身抗原与临床可用的免疫抑制药物71和临床前耐受性信号通路配体72的联合传递导致了自身免疫的抗原特异性抑制。在稳态过程中，T细胞和树突状细胞之间的相互作用，通过阈下协同刺激提供抗原，导致T细胞对自身抗原无能为力11.最近，研究表明，修饰有MHC i -肽51和MHC ii -肽复合物50的纳米颗粒可以模拟具有亚-抗原的树突状细胞阈值co-stimulation。这为诱导免疫耐受提供了一种新的选择。

疫苗接种途径中的关键步骤:与纳米颗粒相关的优势和挑战

在诱导CD4+和CD8+ T细胞反应的疫苗接种途径中有几个关键步骤。它始于未成熟的树突状细胞捕获抗原。树突状细胞是由造血干细胞在骨髓中产生的。然后它们进入血液循环，到达组织，寻找抗原。与抗原一起捕获的病原体和损伤相关的分子信号的处理导致它们的成熟和树突状细胞迁移到淋巴结。在那里，树突状细胞与T细胞相互作用，共同呈现抗原和共刺激因子，并释放细胞因子来激活T细胞(图3)。

dc对抗原的捕获

树突状细胞摄取抗原的常见机制有吞噬作用和巨胞吞噬作用这些是许多免疫细胞采取的方法，包括dc、巨噬细胞和中性粒细胞73这两种机制都在巨噬细胞和中性粒细胞清除微生物和树突状细胞收集抗原中发挥重要作用。大胞饮作用是细胞表面凸起物包围周围的液体，形成微米大小的大胞饮小体大量胞饮是自由溶解蛋白质或肽抗原的主要摄取途径。已经发现，几十纳米大小的小纳米颗粒也可以通过这种内吞途径进入免疫细胞对于较大的颗粒，如微生物和细胞碎片，内化主要涉及沉积吞噬细胞沿靶细胞边界的细胞膜，最终形成一个紧密包围并内化靶细胞的吞噬体。

据报道，携带纳米颗粒的抗原(与基于小分子的抗原相比)具有更高的细胞吸收效率。对此现象的一种解释是纳米颗粒表面(具有特定的表面功能化或电荷调制)与细胞膜之间具有较高的亲和力。例如，对带负电荷的裸mRNA的摄取率小于1 / 10,000初始输入分子采用表面带正电荷的纳米载体可显著提高这些抗原的吸收(高达80-95%)。研究还发现，带有dc特异性表面受体配体(如CD11c、CD40和DEC205)的纳米载体的表面功能化也能有效地促进它们被dc吸收。例如，用抗DEC-205抗体修饰的纳米载体可以有效地将抗原传递给DEC-205阳性的dc用抗体、多肽或受体配体修饰纳米粒子的表面可以同时导致dc的靶向和激活。然而，体内对受体靶向的反应是物种特异性的，并且从动物研究直接转化到人类常常不是那么简单的。最近的两项研究证实了受体靶向的巨大潜力和复杂性。在第一项研究中，Conniot和同事探索了甘露糖基化NPs用于癌症疫苗的应用84。与之前的研究一致，纳米粒上的甘露糖功能导致通过甘露糖受体的dc靶向，增强了由纳米粒携带的抗原和佐剂的传递，与非甘露糖基化对照相比，产生了更强的抗肿瘤反应。然而，对肿瘤微环境的详细分析显示，甘露糖基化纳米颗粒免疫也导致了未预见到的髓源性抑制细胞(MDSCs)的流入，这可能会否定对疫苗效力的影响。因此，研究团队将MDSC抑制剂ibrutinib纳入免疫方法，并证明这种新的治疗方法可以最佳地应用甘露糖基化癌症疫苗。在第二项研究中，研究了糖基化的HIV抗原以单体形式或齐聚成纳米颗粒诱导体液反应85。这些抗原通过甘露糖受体靶向APCs。单体和寡聚形式诱导了相似水平的卵泡辅助T细胞反应，表明靶向树突状细胞的效率相似。然而，它们引起了不同程度的体液反应。这些不同的体液反应的原因可以追溯到引流淋巴结的滤泡树突状细胞。这一有趣的结果表明，在受体识别过程中，不同类型的细胞可能有几何或大小的要求，从而允许利用物理特性对目标进行微调。

用于细胞摄取的纳米载体的最佳尺寸通常随材料组成和细胞类型而变化。~ 100 nm的纳米颗粒被认为是最有利于树突状细胞摄取的。这种大小与树突状细胞的自然目标:病毒和细菌相匹配。一般来说，当纳米颗粒的大小超过500 nm时，它们往往被DCs吸收效率较低，主要被巨噬细胞吞噬781。（开题讲解）

几何形状是一个高度研究的形态学参数与细胞摄取。由于许多基于聚合物和无机材料的纳米颗粒可以以不同的尺寸和长宽比合成，因此已经用不同的细胞类型评估了几何形状对摄取的影响。87 - 90。棒状纳米粒子和长椭球粒子的吞噬作用与球形纳米粒子相似或不如球形纳米粒子，而扁椭球粒子比球形纳米粒子的吞噬作用更有效。88 - 90Niikura等比较了球形、棒状和立方状Au NPs对dc的吸收效率，发现棒状Au NPs对dc的吸收效率略高。相反，立方体状Au NPs的内化效率最低。一般来说，纳米颗粒与质膜的接触面积越大，细胞膜上的NP锚定概率就越高;然而，NPs的国际化也依赖于膜皱褶的可能性，这是一个能量依赖的过程。92,93遵循类似的原则，柔软的可变形纳米颗粒可以提高吸收效率在最近的一份报告中，Xia等人证明了由PLGA稳定的角鲨烯乳液制成的柔软柔韧的微颗粒比固体PLGA微颗粒提供了3倍的抗原。94除吞噬作用外，已知纳米颗粒系统通过其他胞吞作用途径进入细胞一般认为，大小不超过200 nm的纳米颗粒可以进行网格蛋白介导的内吞作用。腔泡介导的摄取可能对颗粒大小有更严格的限制，因为腔泡依赖的内陷通常涉及颗粒。大于80nm然而，在文献报告中存在差异，这些各自的大小可能取决于细胞系。考虑到在体内摄取纳米颗粒，可能会出现进一步的并发症，因为不同的细胞类型会争夺有限的纳米颗粒供应。值得指出的是，某些内吞途径，如小泡介导的途径，可以将吞噬的货物引导到特定的细胞内囊泡，97可能改变了纳米颗粒所承担的细胞内加工途径。因此，针对特定内吞通路的NPs表面工程可能为疫苗设计提供新的机会。

基于纳米颗粒的抗原传递的其他优势来自于纳米颗粒和自由溶解抗原的药代动力学差异。自由溶解的抗原很容易以多种方式被消耗，主要是通过扩散到体液和循环以及随后的稀释。相比之下，纳米颗粒的生物分布很大程度上取决于它们的大小。我们知道小于5 nm的纳米颗粒很容易通过肾系统退出循环，但那些较大的纳米颗粒(20-200 nm)的循环时间较长在循环中，更大尺寸的纳米颗粒通常更有可能被单核吞噬细胞系统(MPS)捕获，例如被肝脏Kupffer细胞脾脏的巨噬细胞捕获。

对于某些疫苗的应用来说，特别重要的是纳米颗粒在淋巴结中富集的可能性。这是很重要的，因为增强的淋巴运输允许直接进入淋巴样节点的树突状细胞，增强B细胞对抗原的摄取和呈递，增强体液反应，28。图4注射后，小纳米颗粒有效地穿过淋巴上皮到达引流淋巴结。(a)共注射荧光团标记的25 nm和100 nm纳米颗粒后小鼠尾部的荧光微淋巴管造影图像。25 nm NPs比100 nm NPs更有效地进入淋巴网络。比例尺:1mm。(b)引流淋巴结的荧光显微镜图像。24小时后，25 nm NPs比100 nm NPs更有效地到达淋巴结。这些纳米颗粒被发现具有更高的淋巴结转运效率99(图4)。在这种效果的一种实现中，10纳米，负载肿瘤抗原，研究发现，由合成高密度脂蛋白(sHDL)制成的圆盘状纳米颗粒具有有效的ln靶向传递，与自由溶解的抗原相比，可显著增强抗肿瘤免疫反应。100种抗原可能扩散到体液中，并因其体积小(<2 nm)而被稀释。

图4注射后，小纳米颗粒有效地穿过淋巴上皮到达引流淋巴结。(a)共注射荧光团标记的25 nm和100 nm纳米颗粒后小鼠尾部的荧光微淋巴管造影图像。25 nm NPs比100 nm NPs更有效地进入淋巴网络。比例尺:1mm。(b)引流淋巴结的荧光显微镜图像。注射24小时后，25 nm NPs比100 nm NPs更有效地到达淋巴结。比例尺:200 μm。经施普林格自然杂志许可，转载自ref. 28

通过适当的纳米颗粒配方在注射部位保留抗原，也可以显著增强树突状细胞对抗原的摄取和呈递，在许多纳米颗粒配方的情况下，形成增强免疫原性的基础。（开题报告）在组织中，大于200nm的纳米颗粒被细胞外基质有效地保留，因此它们向淋巴结的运输必须得到树突状细胞的帮助。也就是说，它们在进入淋巴结之前需要被dc内吞。聚集的抗原比自由溶解的抗原更有效的原因之一是在注射部位的保留。

如果想充分利用纳米技术，成功地将抗原装载到纳米载体上是一个先决条件。能有效地将抗原传递到树突状细胞的颗粒载体。抗原有不同的形式，包括蛋白质/多肽、DNA和mRNA，具有不同的化学和物理特性。这些生物聚合物在物理和化学性质方面可能有很大的不同，因为它们的序列和组成可以改变，使它们单独应用具有挑战性。装载到纳米颗粒上可以提供一个通用的平台来处理不同的抗原。

表3总结了用于抗原装载的不同类型的材料以及相关的疫苗接种效果。蛋白质和多肽抗原可以被封装成纳米载体，通过电荷或化学作用与纳米载体结合，或在纳米载体表面吸收。DNA和mRNA固有地诱导强烈的MHC i介导的CD8+ T细胞反应，78102，这对癌症疫苗的有效性至关重要。对于这些抗原，纳米颗粒载体提供的保护对抗原在体内传递很重要;事实上，纳米载体的使用特别使信使rna抗原应用于疫苗应用成为可能，61作为mRNA，否则在细胞外空间rnase降解。与蛋白质/多肽型抗原相比，将这些基于多核苷酸的抗原装载到纳米载体上需要额外的考虑，因为DNA，尤其是mRNA在化学上是不稳定的，当它们被装载到纳米载体上时，它们无法在许多严苛的化学/物理操纵技术中存活。

脂基纳米颗粒已经被FDA批准用于各种纳米医学应用，为核苷酸抗原的负载提供了一个可行的解决方案。这些纳米颗粒载体通常是用两亲性脂质材料制备的，这些脂质材料含有极性头部基团和非极性尾部带正电荷的脂质，比如DOTAP(1, 2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium丙烷）通常用于通过静电相互作用包封多核苷酸抗原。这样的封装可以在不涉及苛刻过程的情况下完成。装载多核苷酸抗原的其他载体选择包括使用阳离子聚合物，它们也通过静电吸引封装。例如，聚醚酰亚胺(PEI)用于艾滋病毒抗原编码mRNA递送，并报道了强烈的全身和黏膜艾滋病毒特异性免疫应答。109上述抗原加载策略为非原位过程;即抗原的装载发生在纳米颗粒疫苗制备过程中(图5a)。最近，出现了一种非常不同的方法，该方法可以在体内注射为抗原捕获量身定制的纳米载体，而不需要预先装载抗原。这些新型颗粒捕获肿瘤抗原在肿瘤细胞免疫原性死亡过程中释放(图5b)。

图5纳米颗粒剂型疫苗的装填方案。(a)非原位:将预先制备的抗原(佐剂)装入纳米颗粒，然后将其注射到小鼠体内，在此过程中，纳米疫苗将被树突状细胞捕获。(b)原位:在各种治疗方法诱导的肿瘤细胞死亡过程中产生抗原。它们被注射到小鼠体内的纳米颗粒捕获，形成一种能够摄取DC的纳米疫苗。

一些治疗方法，如光动力/光热疗法、放射疗法和某些化疗，现在已知会导致肿瘤发生免疫原性细胞死亡，释放肿瘤相关抗原。关于细胞程序性死亡的生物学过程的详细讨论可以在最近的一篇综述文章中找到这种原位抗原加载策略具有与采用迁地加载方案的传统癌症疫苗相比，具有成本效益和健壮性的优点，因为后者需要肿瘤新抗原个性化以最大限度地提高疫苗效力。122因此，纳米颗粒可以促进免疫原性细胞死亡，并有效地捕捉抗原，这是一个巨大的研究兴趣。例如，Min和同事开发了基于plga的抗原捕获纳米粒(AC-NPs)，能够通过化学或物理相互作用与肿瘤相关抗原结合。他们发现这些AC-NPs可以促进dc对肿瘤抗原的摄取和呈递，从而导致CD8+ T细胞的活跃。在另一个例子中，Wang和同事使用磷脂稳定的胶束纳米颗粒传递吲哚菁绿，并通过光动力疗法诱导肿瘤细胞死亡和抗原释放。肿瘤抗原被纳米颗粒表面的马来酰亚胺在原位捕获，这种方法在小鼠模型中证明了对转移性癌症的治疗效果。

由树突状细胞呈递抗原

dc获得的抗原通过两种不同的途径进行递呈:MHC II抗原递呈途径用于CD4+ T细胞活化;以及CD8+的MHC I表达途径T细胞激活。图6是主要MHC I和II通路的示意图。

图6不同抗原递呈机制;注:吞噬体交叉表达途径，一个涉及抗原结合到MHC I复合体再循环到吞噬体的次要机制，在本例中不包括。

MHC II分子仅由树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和黏膜上皮细胞表达;其中，树突状细胞负责迁移到淋巴结，与T细胞相互作用，导致适应性反应的启动和传播MHC II分子在内质网(ER)中以膜结合复合物的形式合成，其不变链(II)阻断了MHC II肽结合位点。MHC II-Ii复合体从内质网通过高尔基体运送到质膜，然后通过网格蛋白介导的内吞作用返回。MHC I分子广泛表达于哺乳动物体内所有有核细胞中。MHC I途径主要表现为来自细胞内抗原(胞浆蛋白和膜蛋白)的多肽，这些多肽可以自生或由病毒或纳米颗粒DNA/mRNA载体从外部引入。抗原的肽段是通过胞质蛋白酶体消化相应的蛋白抗原而获得的。这些肽段被抗原处理相关转运体(TAP)转运到内质网(ER)腔，并与MHC结合。这包括蛋白质抗原从内溶酶体腔室到胞质腔室的运输另一个次要的交叉呈递途径涉及膜结合小泡中的抗原加工，如吞噬体，使用MHC II途径中相同的抗原加工酶，并与回收到这些小泡中的MHC I复合物结合。由此产生的MHC i -肽复合物然后被运送到质膜进行抗原呈递，其方式类似于MHC II途径交叉表现主要由CD8+ DC亚群完成。

常见的纳米颗粒载体系统通过内吞途径进入细胞;一个直接的结果是，它们驻留在膜结合的小泡中(即内溶酶体)，目的是进行抗原处理和MHC II呈递。结合以上讨论的组织保留和增强细胞摄取的影响，纳米颗粒配方有可能增强MHC II蛋白或肽抗原的呈现，以激活CD4+ T细胞。

相反，对于以mRNA形式传递的抗原，需要转位到细胞液(转染)才能转译为蛋白质，MHC I途径是抗原提呈的主要方式(详细内容如下)。MHC II表达增强已成为与mRNA抗原相关的一个重要问题。

最近已经通过序列水平的修改实现了诱导ER易位，并在抗原处理室中定位翻译后的抗原，用于MHC II呈递。一个显著的ER易位信号的例子是由Sahin集团开发的MITD信号序列。

mRNA或DNA抗原被使用时，它们在树突状细胞的细胞液中被翻译成编码蛋白是随后抗原呈递的首要条件(图6)。这需要从细胞外空间转染一个多核苷酸到细胞液中。就DNA而言，它也必须进入细胞核，才能转录成mrna。只有在有丝分裂时，核膜的解体和细胞核的重组才允许抗原进入细胞核，这种DNA的核运输才有效否则，必须采用复杂的策略，如将含有细胞核定位信号的信号肽化学偶联到DNA，以提高核转运效率。使用病毒转染载体可以增强核转运，但这也可能引起危及生命的免疫病理或增加癌症的风险由于dc在体内不分裂，DNA从细胞质到细胞核的运输仍然是DNA疫苗开发的一个艰巨挑战。

与DNA相比，mRNA抗原直接在细胞质中工作，不需要核进入许多以纳米颗粒为基础的策略已经被开发出来，使mrna的胞质传递成为可能。一种策略是利用质子海绵效应，使被内吞的纳米颗粒通过囊泡逸出进行胞质输送这涉及到一个带正电荷的载体，它可以在核内体酸化过程中吸收质子，导致渗透肿胀和随后的核内体破坏。聚醚酰亚胺(PEI)109和聚β氨基酯(PBAE)136是质子海绵效应的常见材料体系。

另一种胞质递送多核苷酸抗原的策略是使用阳离子脂基载体。阳离子脂质和阴离子内体膜之间的静电相互作用可以导致囊泡膜的破坏，从而允许细胞内运送所携带的货物。另外，可以配制阳离子脂基载体直接与质膜融合，通过细胞表面将多核苷酸物质释放到胞浆中。阳离子脂类，如lipofectamine，已在商业上获得，它们的高RNA转染效率已得到充分证明然而，一些研究表明，阳离子脂基给药系统与体内毒性有关。几种方法已经被用来降低阳离子脂类的毒性。一种是通过添加中性的辅助脂质，如1,2-二油酰- sn甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来降低纳米颗粒配方中阳离子脂质的比例。辅助脂质在核内体逃逸过程中也起着重要作用另一种降低毒性的方法是用弱阳离子脂类取代强阳离子脂类，如1,2-二油酰-3-二甲基-氨-丙烷(DODAP)。含有透明质酸层的脂质纳米颗粒也被发现能降低体内毒性。在其他纳米颗粒表面修饰阳离子脂质已被发现能够实现胞质传递。Kim等人将融合脂质体涂在多孔硅NPs (pSiNPs)表面。144他们证明，融合型pSiNPs通过融合型摄取直接到达细胞质，而非融合型pSiNPs通过内吞作用然后定位于细胞质。因此，直接胞质释放的融合基因途径比内体摄取途径获得更高的转染效率。这种递送策略避免了内吞途径，并阻止了mRNA抗原在核内体中的降解。

由于蛋白质和多肽的胞质递送是交叉呈递的关键步骤(图6)，可以利用通过核内体逃逸或膜融合的胞质递送的纳米颗粒配方来增加蛋白质和多肽抗原的MHC I呈递。与信使rna的胞质传递类似，阳离子脂质s145和聚合体146已被用于提高MHC I蛋白和肽抗原的表达。另一个既定的策略是调整纳米颗粒载体的降解性。147 .在细胞水平上，调节纳米颗粒的降解性可以导致抗原被定向到不同的内溶酶体间室，使抗原呈偏向MHC I或MHC II途径动物研究表明，在癌症和牛痘病毒模型中，效果有所提高。

如何诱导CD8+ T细胞应答以预防癌症和病毒感染是一个重要的课题。为此，多年来开发的各种策略已致力于改善MHC I的纳米颗粒携带抗原的呈现。这些包括使用MHC i限制性多肽和mRNA抗原，以及交叉表达增强策略(包括受体靶向和调整纳米颗粒特性，如上文所述)。目前，上述策略均未显示出明显的优势。由于每种策略都是为特定类型的纳米颗粒设计量身定制的，在可预见的未来，这些策略可能仍然是开放的选择，允许不同的纳米疫苗设计实现有用的CD8+ T细胞应答。

树突状细胞的成熟

未成熟的树突状细胞在主动采集环境中抗原的同时进行间质巡逻它们迁移到淋巴结，也就是T细胞所在的地方，抗原呈递是通过向成熟表型的转变实现的。这种吞噬细胞中树突状细胞特有的表型变化被称为成熟。

未成熟的树突状细胞在存在促炎细胞因子、1075个模式识别受体(PRR)配体、23个免疫刺激外泌体、150个或补充31或免疫球蛋白151修饰颗粒的情况下可以转变成成熟的表型。这些刺激物引起的信号级联反应激活转录因子NF-κB，从而导致表型改变，包括由于细胞资源的重新分配用于迁移，表面粘附性的丧失，C-C趋化因子受体(CCR7)的表达用于淋巴结定向粘附。这导致成熟树突状细胞从组织主动迁移到淋巴系统。此外，NF-κ b介导的成熟导致了MHC II合成的上调和MHC II复合物从内溶酶体室重新分布到质膜上，增强了MHC II向CD4+ T细胞的呈递。在成熟过程中，伴随这些步骤的还有细胞膜上共刺激分子的表达130和细胞因子生产能力的增加73，这两者都是形成CD4+和CD8+ T细胞反应和记忆的必要条件。

在稳定状态下，未成熟树突状细胞通过自发的Iκκβ转录因子激活而成熟。153 . i κκβ介导的成熟导致树突状细胞淋巴结迁移，促进外周对自身抗原的耐受性因此，通过NF-κB而不是Iκκβ诱导树突状细胞成熟，激活树突状细胞对癌症疫苗的保护和治疗效果至关重要。对于治疗性癌症疫苗，刺激树突状细胞成熟尤其重要，因为树突状细胞上的共刺激分子可以重新激活因长期暴露于肿瘤抗原而耗尽的T细胞41。

使用纳米粒子联合递送PRR配体和抗原是诱导抗原呈递DC成熟的一种流行策略。为疫苗应用开发的大多数常见PRR配体已被证明与纳米颗粒配方很好地工作，提高免疫应答和疫苗效力。其中包括TLR3配体聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I:C))，154 TLR4配体单磷酸脂质A (MPLA)，56 TLR7/8配体咪喹mod56和TLR9配体CpG寡核苷酸。协同作用允许多个PRR配体使用一个单一的纳米颗粒共递送已经被报道在设计PRR配体的纳米载体时，人们应该注意到不同的PRR家族成员位于不同的细胞隔间。这意味着纳米颗粒的设计需要满足特定的传递要求，例如核苷酸结合寡聚域受体(NLR)配体的细胞内传递，TLR4配体的细胞表面传递，以及TLR3、7/8和9配体的内体释放。此外，颗粒设计应考虑几何要求，特别是尺寸要求，以最佳刺激内体受体，如TLR9,25,26。

另一方面，可以通过不同的方式获得多模态纳米颗粒配方。一些纳米颗粒由于其固有的化学/物理参数而具有固有的佐剂性(表3)。已知许多纳米颗粒系统能内在地刺激炎症小体反应这些通常是具有尖锐边缘的颗粒，如铝和各种可以破坏吞噬体膜稳定性的晶体颗粒材料。事实上，明矾常被用作佐剂。对于市场上的疫苗，62虽然其纳米颗粒形态尚未被有意识地强调。具有尖表面的氧化钛颗粒(图7a)也被证明可以刺激炎症小体反应，触发DC成熟，并增强疫苗在流感防护和肿瘤减少方面的效果。

近年来，机械力被认为是免疫系统中细胞信号传递的重要调节因子据此，可变形性被认为是佐剂效应的另一个因素。Xia等人基于PLGA纳米颗粒稳定的Pickering乳液体系设计了柔韧性的微粒，用于装载抗原94(图7b)，测试了纳米颗粒的变形性对免疫反应的影响。增强的免疫反应部分归因于柔韧颗粒刺激DC成熟，而非非柔韧颗粒。佐剂性也可能来自于纳米颗粒表面的特殊化学性质。例如，Luo等人发现阳离子聚合物基纳米颗粒功能化azepanyl可以刺激干扰素基因(STING)家族细胞内受体，导致细胞内抗原的同时传递和树突状细胞的活化。使用杂环胺配体的同样的STING激活策略也被需要强调的是，naïve CD4+ T细胞分化为效应T辅助细胞的前提是且仅当树突状细胞在病原体相关分子模式(PAMPs)、损伤相关分子模式(DAMP)或细胞因子驱动的信号下同时呈现同源抗原。如果没有这样的信号提供，naïve CD4+ T细胞认为抗原是自源的，并进入无能状态15这是病原体和肿瘤细胞用来逃避免疫系统的主要漏洞之一。应用于脂基纳米粒的mRNA传递，以增强抗肿瘤免疫。

细胞毒性T细胞和T辅助细胞活化

细胞毒性或CD8+ T细胞识别MHC I复合体上的抗原肽并进行激活。它们利用分泌的穿孔素和颗粒酶或fas介导的细胞死亡途径中的细胞表面CD95L诱导感染细胞或肿瘤细胞死亡CD4+ T辅助细胞对CD8+ T细胞的辅助作用是细胞毒性T细胞最佳活化所必需的然而，也有报道称，通过适当的PRR配体(如poly(I:C))激活DCs，可以在没有CD4+ T辅助细胞的情况下充分激活CD8 T细胞。

它们还可以进一步细分为3个特征明确的亚型，每一个亚型都专门针对一组特定的病原体。表4列出了它们的主要特点。在MHC II激活后，naïve CD4+ T细胞分化(或极化)为不同TH细胞亚型是由dc提供的细胞因子和共刺激分子谱决定的。表4列出了驱动TH细胞极化成相应亚型的感染因子(dc刺激和先天免疫系统刺激)。还列出了涉及的PRR子集和刺激极化过程的细胞因子。然后，每个TH细胞亚型产生一组特征性的效应细胞因子，这些效应细胞因子作用于一系列附属细胞，从而对感染因子产生适当的免疫反应。

以抗病毒TH1反应为例，TH细胞发挥的中央协调功能得到了最好的证明病毒感染驱使CD4+ T细胞极化成TH1亚型。这一过程始于树突状细胞的prr(如TLR3, 7/8或9)检测病毒RNA和DNA。在识别这些病毒PAMPs后，树突状细胞被激活并成熟。被感染者分泌的I型干扰素促进了成熟过程。组织细胞。这导致树突状细胞在向naïve CD4+ T细胞递呈抗原时共刺激因子的上调和IL-12的释放。IL-12驱动活化的CD4+ T细胞分化，采用TH1极化。然后TH1细胞产生IFNγ， IFNγ传播一系列抗病毒反应:在感染细胞上，IFNγ驱动MHC I呈递通路的上调，促进细胞毒性T细胞识别和杀死感染细胞。它还诱导抗病毒基因的表达，以抑制病毒在感染细胞中的复制。IFNγ增强B细胞产生的抗体用于病毒中和。此外，IFNγ促进NK细胞活性，以协助清除感染细胞，并作用于巨噬细胞，以促进清除感染细胞碎片。IFNγ也通过上皮细胞诱导信号传导来招募中性粒细胞。这种TH细胞通过细胞因子分泌协调免疫反应的一般主题在对抗寄生虫感染的TH2极化和对抗细菌感染的TH17极化中得到了很好的保存。

除了细胞因子外，成熟树突状细胞上的共刺激分子已知在CD4+ T辅助细胞的激活中发挥重要作用共刺激分子CD48、CD58、CD70、CD80、CD86和LIGHT促进naïve CD4+ T细胞活化为效应T辅助细胞。CD70和LIGHT对TH1极化很重要，而SLAM、TIM和CD30L对TH2极化很重要。在它们的生命周期结束时，一部分效应T细胞分化为记忆细胞，在随后的抗原遭遇中提供回忆(或二次)反应回忆反应的强度和记忆存活的时间长度通常与细胞因子和共刺激分子刺激的强度有关。与任何相关的体积和表面积纳米系统提供一个自然平台co-delivery抗原和各种形式的分子佐剂,TLR配体等近几十年来已经发现的一个关键组成部分产生有效的免疫反应而持久的memory.62。纳米粒子协同递送抗原和分子配体的优势在于其到达目标树突状细胞的空间和时间重叠，允许同时处理和相关的T细胞激活。

在没有纳米颗粒载体的情况下，分子配体与抗原的共传递通常是通过分子配体与抗原的化学偶联来实现的。虽然这种方法有它自己的优点，相同分子配体和抗原的纳米颗粒配方可以提供类似的结果，但在微调配方方面具有更大的灵活性通过调整纳米粒子参数和配体组成。

事实上，由于多重功能在空间和时间上的重叠，通过纳米颗粒载体的共递可以显著改善免疫反应5。这已经在体液和细胞免疫反应中被证明，许多不同的纳米颗粒配方，而不管给药途径。25,100,148,149,163,164。例如，共同递送TLR配体的协同作用比同一配体的共同给药的反应强得多，56因为后一种方法由于药代动力学的不同，不能保证TLR配体在同一位置同时可用。在最近的一项研究中，Kuai等人使用合成高密度脂蛋白(sHDL)纳米片共同递送肽抗原和佐剂CpG.100与相同成分的物理混合物相比，纳米盘纳米颗粒诱导了更高水平的抗原特异性T细胞反应(图8)。

图8在合成高密度脂蛋白(sHDL)纳米片上共递抗原(Ags)和CpG佐剂可诱导强抑肿瘤。左上角:纳米盘纳米颗粒的制备和结构示意图;sHDL，高密度脂蛋白;左下:纳米颗粒的透射电子显微镜成像显示纳米圆盘状形态;比例尺，100nm;右图:与不进行治疗和抗原和佐剂的物理混合治疗相比，使用sHDL-multiAgs/CpG纳米片的动物免疫能强烈抑制肿瘤生长。

结论与未来展望

纳米技术提供了有用的工具，以了解免疫系统的基本工作原理分割方式，使精确和独立的控制材料参数，可能有影响的免疫过程。目前免疫学研究的趋势是在亚微米水平上从力学特性和几何排列的角度来处理免疫细胞的相互作用，纳米技术将在免疫学的未来发现中发挥越来越重要的作用。虽然合理的疫苗开发高度依赖于对免疫系统的机制理解，但通过将纳米技术应用于免疫学研究而获得的知识无疑将转化为疫苗开发的新战略。

疫苗的工作机制需要结合不止一种功能，即必须同时存在抗原和佐剂。抗原和佐剂都有不同的形式，并可能倾向于特定的传递位点。在这方面，纳米颗粒能够安全适应多种功能，并提供多种策略来满足特定的交付要求。PRR配体的共递是纳米颗粒疫苗最早的突破之一，56并且仍然是大多数纳米颗粒疫苗实施策略中不可或缺的一部分。增强效力的疫苗已经过多次试验和验证。在许多情况下，这种增强来自于安全装载货物(抗原和佐剂)，避免它们在血液循环系统中迅速降解，纳米颗粒和树突状细胞之间的相互作用改善了抗原的吸收。值得指出的是，传统的非原位加载策略在很大程度上依赖于有效抗原的可用性，而这种抗原的加工可能是昂贵的。相比之下，最近开发的用于癌症疫苗的原位抗原加载策略已经显示出了巨大的潜力，但如何优化纳米颗粒载体的特异性抗原生成和捕获能力的关键问题仍然是一个悬而未决的问题。被装载货物的触发和/或可编程交付是纳米颗粒配方的一个独特特点，并已广泛应用于纳米药物设计的广泛治疗应用。然而，在纳米颗粒配方疫苗的情况下，这种策略很少被探索，尽管它显然很重要;例如，抗原和佐剂传递的时间顺序是至关重要的，因为佐剂会促进DC的成熟，成熟的DC不再倾向于抗原吸收。

纳米颗粒配方疫苗研究最多的方面之一是纳米颗粒本身的佐剂效应。除了化学方面的例子，纳米颗粒的许多物理特性已经被发现具有很强的佐剂效应。例如，通过纳米颗粒可分解性调节的MHC I呈现增强已被应用并在各种需要强细胞毒性T细胞反应的保护和治疗模型中得到验证。然而，这些免疫调节现象背后的生物学过程目前还没有完全了解。具有锋利边缘的纳米颗粒可以破坏内溶酶体结构，从而引发炎症小体反应已知可提高疫苗的功效。这些纳米颗粒系统的免疫调节作用的机制可能会改进疫苗的设计。另一方面，值得指出的是，在疫苗接种的关键免疫成分中，操纵MHC II呈递是一个很大程度上被忽视的方向。基于纳米颗粒的新策略的应用可能提供了对MHC II呈递调节的自然工作机制的早该洞察，并开辟了增强对现有疫苗应答的新方法。体液免疫是一个非常有趣的话题，因为它是许多疫苗对抗病原体的关键保护关联。体液反应的发展是一个包含多个步骤和细胞成分的过程。就目前已知的关键步骤而言，它包括:(1)卵泡辅助T细胞(TFH)的发育;(2)抗原捕获和B细胞活化;(3)形成生发中心;(4) B细胞类切换;(5)亲和成熟，B细胞、TFH细胞和滤泡树突状细胞(FDCs)参与了这一过程。关于这些生物过程的进一步讨论可以在一些深入的综述中找到。166 - 168。

通过纳米颗粒配方的抗原增强体液免疫反应是一个被充分证明的和可重复的现象，并且已经建立了许多通过纳米颗粒配方增强体液免疫的标准。这些都是在本文中提到的，包括:(1)最佳的纳米颗粒尺寸(~ 40 nm的直径);(2)抗原表面以重复的几何图案装饰;(3)抗原与分子佐剂共递，比如TLR配体。然而，在细胞水平上解释这些标准的潜在机制尚不完全清楚。例如，高效的淋巴运输被认为是使用小纳米颗粒增强免疫反应的原因。从实验性癌症和病毒纳米疫苗的经验来看，我们确信，小的、靶向淋巴结的纳米颗粒可以通过DC-T细胞轴增强T细胞的反应。但是这些纳米颗粒与B细胞之间的相互作用，以及与fdc之间的相互作用是否有作用呢?目前，由于B细胞对抗原在纳米颗粒表面的几何排列的敏感性，许多相关的观察结果被掩盖了。同样，许多涉及抗原几何形状的实验也没有考虑到抗原大小的差异。更复杂的是，一些研究表明，抗原的翻译后糖基化状态可以影响细胞类型的参与。了解npenhenhanced体液反应的基础机制，可以为进一步改进纳米疫苗和真正合理的体液免疫疫苗设计提供见解。这将给未来的研究人员带来挑战，可能需要更多受控的体外实验来检查纳米颗粒和相关细胞类型之间的相互作用，以及允许测试关键步骤子集的体内模型。虽然大多数研究都集中在纳米颗粒和树突状细胞之间的相互作用上，但目的是通过使用纳米粒子模拟真实的病原体，调节DCs和T细胞之间的通信的努力较少。在这方面，人工抗原提呈细胞在免疫学研究和纳米疫苗开发中的应用特别有趣。然而，目前的aAPC模型仅限于表面受体之间的相互作用，如MHC-TCR，以及共刺激/共抑制的相互作用。然而，天然的DC-T细胞通讯也涉及可溶性因子(例如dc释放的细胞因子)。将目前的aAPC模型与能够以可控方式释放信号分子的纳米颗粒相结合，可能会以更接近的方式模拟DC-T细胞通信，从而更好地理解所涉及的生物过程。aAPC研究的未来前景将在很大程度上依赖于分子生物学家和材料科学家的协同投入。41 .由于aAPCs的构建需要微克高纯度和高活性的蛋白质，因此要超越商用的MHC-TCR和各种表面因子结合抗体，需要分子生物学家在dc和T细胞上发现的无数表面信号分子的制备。

aAPC研究的未来前景将在很大程度上依赖于分子生物学家和材料科学家的协同投入。41 .由于aAPCs的构建需要微克高纯度和高活性的蛋白质，因此要超越商用的MHC-TCR和各种表面因子结合抗体，需要分子生物学家在dc和T细胞上发现的无数表面信号分子的制备。关于膜蛋白的制备的详细讨论可在别处找到与此同时，材料科学家设计的纳米颗粒模型可以作为表面蛋白质特定几何排列的基质，或允许可控的力学特性，将允许对与免疫相互作用的几何和力学要求相关的观察和推测进行测试。有了aAPCs, dc和T细胞之间的体内通信可以直接和系统地研究，这为超越kn更高效的疫苗开发铺平了道路。

Nanoparticles (NPs) are gradually becoming a mature platform for antigen delivery with multivalency and increased size, and recombinant expression of antigenbearing nanoparticles has become a new challenge for vaccine development due to increased structural complexity during nanoparticle assembly (38-40). Since covalent protein conjugation has been widely used in protein modification, we adopted a similar strategy to construct S1 nanoparticles (41-43).

纳米颗粒(NPs)正逐渐成为一种成熟的多价、增大尺寸的抗原传递平台，由于纳米颗粒组装过程中结构的复杂性增加，携带抗原的纳米颗粒的重组表达已成为疫苗开发的新挑战（38-40）。由于共价蛋白偶联在蛋白质修饰中得到广泛应用，我们采用类似的策略构建S1纳米颗粒（41-43）。