专家讲解新型冠状病毒的检测
撰文 | 王萍
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现在有哪些检测新型冠状病毒的方法？
检测传染病的策略通常有两种：检测病原体本身，或检测人体为了抵抗病原体而产生的抗体。检测病原体既可以检测抗原 （一般是病原体表面蛋白，有些用内部核蛋白），也可以检测核酸。如果病人的体液中检测到抗体、抗原或核酸三者中的任何一种，则意味着已被感染。由于抗体产生需要时间，一般几天至几周不等，有些免疫功能较弱的病人可能抗体量很低，容易造成假阴性（已经感染，但是测试结果看起来没有被感染）。而在感染之初，病原体抗原含量也较低，同样不容易检测到。所以，目前广泛采用的是检测病原体的核酸序列， 通过扩增反应来放大信号， 检测的灵敏度高、特异性好。
早在1月11日，新型冠状病毒的全基因序列就已发布（由上海市公共卫生临床中心和公共卫生学院、华中科技大学武汉中心医院、武汉市疾控中心、中国疾控中心传染病预防控制所联合澳大利亚悉尼大学联合完成），国内和国际多个厂家和机构都迅速跟进，开发检测试剂盒。检测试剂盒可以一次性检测几百个样本，而在开发出检测试剂盒之前，一般只能通过RNA测序方法检测病毒，速度会很慢。
新型冠状病毒和SARS病毒的高度同源性对试剂盒设计也有帮助。由于新型冠状病毒是RNA病毒，试剂盒检测基本都采用反转录加实时聚合酶链式反应法（RT-PCR），扩增病原体的核酸 (RNA) ，同时通过荧光探针实时检测扩增产物。这种方法很灵敏，也能够很好地定量。世界卫生组织（WHO）网站上列有德国、香港、泰国、日本和中国疾控中心所使用的检测方法和引物序列，基本都是针对病毒序列中高度保守的2至3个序列——比如编码replicase（复制酶）或者necleocapsid（核蛋白衣，核鞘）的核酸序列——来进行检测。但是各个方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex，也就是把多个目标序列在同一反应管中扩增；另一些采用分步，先用一个目标序列筛查，阳性后再用另一个序列确认。检测反应的准确程度取决于公布的基因序列的准确程度，以及引物、探针等的设计。从目前公布的有限数据来看，这些试剂盒的准确率都不错。由于现在能检测的病人都是临床高度疑似，所以阳性预测值非常高。
也正是因为这个新型冠状病毒和SARS的相似性很高，如果感染的是SARS病毒，结果也会是阳性的。
当然，也可用测序方法更准确的确认新型冠状病毒， 但是对仪器要求高，速度也慢一些，不适合大批量筛查。
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为什么要multiplex多重反应？为什么要用多个目标序列？
作为筛查手段，要求是快速和高灵敏度。每个RT-PCR反应需要2小时左右出结果，multiplex也就是多个检测平行同步进行，可以有效缩短整个流程时间，加快检测速度。另外病毒变异很快，用多个保守目标序列可以防止病毒变异产生假阴性。
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采样以后，多久能拿到结果？
如果就近在同一个医院可以马上检测的话，2-3小时就应该可以看到结果，但是当地如果感染控制或仪器人员条件不够 （见下个问题），就需要把样本送到区域甚至全国检测中心（比如疾控中心），加上运输时间，可能需要上24小时甚至几天。
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使用检测试剂盒有什么要求？为什么不是每个医院都做？
对新型冠状病毒这样的疾病来说，检测所用的血液或其他体液可能具有高传染性，检测和离心过程中产生的气溶胶可能感染检测人员，所以对检测实验室在感染控制方面有很高要求。SARS病毒要求三级生物安全水平（BSL level 3），埃博拉病毒（Ebola）要求四级生物安全水平（ BSL level 4），必须考虑通风、气压、样本流向（指样本从病房通过什么途径到检验实验室，从哪个门进入，到达实验台后从哪个仪器到哪个仪器，废弃样本怎么处理，从哪个门出实验室等系列流程）等方面（见图2），检测人员也要经过特殊训练。从仪器上来说，至少要有离心机、核酸提取仪器、实时聚合酶链式反应仪器等。所以不是每家医院都有条件做检测。
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试剂盒短缺，来不及检测怎么办？
试剂盒短缺影响确诊人数的统计，但对临床治疗影响不大， 因为迄今还没有针对新型冠状病毒的特效药， 临床上根据病人表现，CT（计算机断层成像）看到肺部典型病变，就可以隔离并开始治疗，治疗也以提供病人生命支持为主，没有必要等待检测结果确诊。如前所述，在疾病高度疑似人群中用一个性能不错的检测试剂去测，由于患病率 （disease prevalence）高，测出的阳性结果有很大可能是真阳性 （positive predictive value阳性预测值高）， 而反之测出的如果是阴性结果，是真阴性的可能性不大 （negative predictive value阴性预测值低），所以试剂盒检测结果基本是起确认临床诊断的作用。
作者简介
王萍，湖北仙桃人，现于宾西法尼亚大学病理检验系任教，任宾西法尼亚大学医院临床化学及中心实验室主任，致力于临床疾病检测，研发和产业转化最新的疾病诊断预后方法。
补充＆提问：
1、试剂盒的检测依据是病毒的保守序列，如果一个染病的人痊愈了，身体有抗体了，过后病毒变异了，他会不会因为已经有抗体就不会中招？就像试剂盒能识别出病毒一样，人体T细胞也能识别出这个变异了的病毒，从而保护人体？
回答：这要看抗体识别的抗原在病毒上是否有变异，如果变异了，原来的抗体就不再能识别这一抗原了。这也是每年的流感疫苗并不能完全防止得流感的原因——因为打进去的疫苗产生的抗体识别不了新的变异流感病毒。
2、请问检测过程中产生的气溶胶指的是核酸吗，是否主要包括DNA？气溶胶感染人的主要途径又是什么？
回答：检测过程中产生的气溶胶指的是样本和试剂液滴在空气中的悬浮颗粒。如果样本包含病毒，这些气溶胶可能包含病毒颗粒，直接通过呼吸道吸入而感染人，或附着在衣物、皮肤上，最终仍然进入呼吸道。如果防控措施不到位，检测甚至会扩大污染范围。另外操作不规范的话，气溶胶也可能污染别的样本甚至实验室，导致假阳性结果的产生。
3、荧光探针检测RNA是什么原理？
回答：RNA 先通过反转录成为 DNA，然后通过链式反应扩增，后面步骤有多种可能性，可以直接用荧光染料和扩增的DNA结合，也可以通过荧光共振能量转移的原理，扩增过程中挤掉抑制探针，让原来被抑制的荧光探针荧光增强。用达到最强荧光一半值的扩增循环数目大小来判定起始RNA的多少。
4、如果人体接触了该病毒的RNA而非完整病毒，RNA是否会在人体内复制并重组成完整病毒？
回答：从现在知道的病理机制来看，病毒需要表面蛋白结合人体细胞表面受体才能进入人体细胞，如果只有RNA的话应该无法进入。
5、据说国内确诊需要做两次试剂盒检测，一次阳性为疑似，两次阳性为确诊。请问这是为了分步检测不同序列吗？还是单纯的重复实验排除假阳性？
回答：我确实听说要做两次，甚至有要求做三次的，其实在高度疑似人群中，真阳性的可能性非常高，除非对操作流程或试剂有疑问，否则没有必要重复。
6、在试剂盒不足的情况下，疑似的患者该怎么办？另外，普通肺炎患者和新型冠状病毒的肺炎患者在CT影像上是否很好区分？
回答：疑似的患者应该隔离，不管在家还是在医院。医院床位不够的情况下应该在家隔离，出现了呼吸症状应该去医院治疗。我不是放射科医生，但是根据各种放射医学文献来看，不同种病毒引起的肺部影像变化有相似之处，也各有独特特征，有经验的放射科医生可以识别。
7、试剂盒检测结果并不能100%准确，那么符合流行病史并出现临床表现的患者 (疑似患者) 就应该和确诊患者一样立即开始治疗吗？
回答：对于高度疑似传染性疾病来说是这样的，隔离应先于确诊，有临床表现就应该开始对症治疗，而且在检测结果出来前，防感染措施要到位，要当作假定结果是阳性来处理。当然，这都是在假定资源充足的情况下。
8、为什么说试剂盒短缺影响确诊人数的统计，但对临床治疗影响不大？
回答：见前一个问题的回答，有条件隔离就应该隔离，有症状就针对症状治疗，没有必要等检测结果确定，即使后来检测结果阴性，隔离也可降低交叉感染机会。检测方面，个人认为，在检测实验室质量控制过关的情况下，除非对检测过程中操作流程或试剂有疑问，否则没有必要重复检测。重复检测会导致需要的时间延长，消耗的试剂增加，失去筛查的快速优势。我目前还没有看到发布的检测结果，如果将来能公布的话，我们应该能看到有多少病例是第一次阳性，第二次或第三次没有确认为阳性的，在目前这种情况下应该很少。
