NHS-Biotin；生物素标记试剂

NHS-Biotin是最常用的胺反应性生物素衍生物，用于修饰蛋白质和其他生物分子。 这种伯胺偶联剂已成功用于体内选择性标记大肠杆菌细胞包膜蛋白。 它优先标记外膜、周质和内膜蛋白以及特定的内膜标记蛋白 (Tet-LacZ)。

图1.NHS-Biotin化学结构

反应原理

已知生物素与抗生物素蛋白牢固结合，其特性已广泛用于高灵敏度分析。由于生物素与抗生物素蛋白之间的结合稳定性常数为1015，比抗原-抗体反应高3至4个数量级，因此一旦结合至抗生物素蛋白的生物素在生理条件下不会脱落。另外，生物素是具有羧基的小分子，可以容易地化学修饰，并且可以在不损害蛋白质等的活性的情况下进行标记。因此，已经开发出许多生物素化合物作为使用抗体进行免疫测定的标记剂。具有活性酯基的生物素通常用于与蛋白质的氨基（NH2）结合，具有马来酰亚胺基的生物素用于巯基（SH）。

图2.NHS-Biotin与蛋白质氨基结合

蛋白质的生物素标记操作方法

1) 用10mmol/l Bicine Buffer (pH8.5) 溶解蛋白质，制成蛋白质溶液。

2) 在蛋白质溶液中加入配制好的生物素标记试剂溶液，蛋白质：生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。

3) 充分混合后，在水浴恒温摇床 (25 ℃) 中培养2-4 h。

标记蛋白质的凝胶过滤及纯化

1) 打开层析柱上的盖子，弃去填充液。

2) 打开层析柱出口的盖子，用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶平衡。

3) 用移液器吸取500μl标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，弃去此时的流出液。

4) 在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，在层析柱中加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。

--biofount范德生物（货号：YZM018905）