穿山甲会是新冠病毒的中间寄主吗？
本文作者：黄宇轩 | 公众号：biokiwi
本文关键词 新型冠状病毒 穿山甲 蝙蝠 宏基因组
前段时间华南农业大学的研究团队在媒体报道中表示，穿山甲可能是潜在的中间宿主，而近日也有来自其他实验室的文章报道了相关的分析和实验结果。
为什么一定要找到中间寄主？穿山甲会是中间宿主吗？希望下面的内容可以告诉你答案。
找到中间宿主为什么这么重要？
当全国开始返程复工，湖北省外新冠肺炎感染人数16连降之时，全国的目光都集中在湖北，集中在武汉的疫情战场，关注于“特效药”的临床实验结果。
此时，我们为什么还要努力寻找新冠肺炎的中间宿主呢？
首先，我们回忆一下钟南山院士说过关于传染病防治的三大要点：
控制传染源
切断传播途径
保护易感人群
前期通过武汉封城，湖北封省，我们切断了病毒从湖北向外传播的途径；
将确诊的非老年轻症患者收治于方舱，重症收治于定点医院，疑似病例在酒店和寝室隔离，也在一定程度上控制了传染源，保护了易感人群（老年人乃至全年龄段）。
但是，请不要忽视，新冠病毒最初肯定是由某种野生动物传染给人。那么，原始的传染源——野生动物如果没有找到，就不能实现真正的完全控制传染源。
那为什么会存在中间宿主？
这次新冠病毒的爆发和03年的SARS有很多相似之处，所以当初的很多经验也可以借鉴。
2003年4月份，很多研究机构已经开始寻找SARS的动物宿主；
5月8日和9日，管轶带领学生在深圳市东门市场取了25对标本，包括8种动物，其中果子狸取了6个样本；
直到5月18日凌晨，管轶和学生才拼接出果子狸中病毒的基因组序列，与SARS具有99.8%的同源性；
又经过一些波折，12月24日，广州发现一例新的SARS疑似病例；
直到2004年1月，才开始清剿果子狸的行动。
中间宿主的清剿，有效遏制了SARS的再次爆发。
但直到2017年年底，中科院武汉病毒所的石正丽团队经过多年的野外标本采集和鉴定才证实，SARS病毒的原始宿主是蝙蝠。
再看回2020年的新冠病毒。
得益于测序技术的发展，加上科研人员多年的基础研究和数据积累，我们在短短6小时，即通过高通量宏基因组测序技术发现了新型肺炎病毒和SARS病毒相类似。
并通过分离培养和鉴定，在1月初发现该病毒基因组与已知的SARS病毒同源性高达96%（下文称此病毒为RaTG13-CoV）。
所以科研人员锁定该病毒的原始宿主为蝙蝠。
华南海鲜市场是否售卖蝙蝠尚无明确证据，而即使是96%的相似程度，也仍和新冠病毒有较大的差异，因此我们认为新冠肺炎病毒很可能存在一个蝙蝠和人的中间宿主。
如何寻找中间宿主？
现在大多数生物学研究，都需要“干湿结合”，也就是既需要实验室的实验验证，也需要前期的数据挖掘和后期生物信息学分析。
顺着这条思路，科研人员也兵分两路，去探寻新冠病毒的中间宿主。
华南海鲜市场至少于12月底、1月初、1月中旬进行过3次采样，从目前已披露的信息得知，12月底并未检测出类似SARS的病毒，1月份的环境样本中则有大量样本检测出新冠病毒基因组序列，然而能否溯源到具体的野生动物暂时还不得而知。
“湿”的路径受到了阻碍，很多科学家开始关注于“干实验”——生物信息学分析。
很快有文献从密码子偏好性方面分析，中间宿主可能来自于蛇。
但是冬天蛇往往在冬眠，且蛇是爬行动物，与人的基因组相差较大，这个可能也因此饱受质疑。
科学家们转而开始利用“大数据”分析潜在的中间宿主。
科学家基于对SARS病毒的研究基础，认为新冠肺炎病毒也具有Spike蛋白，这是冠状病毒包膜上的一种刺突糖蛋白，普遍认为能结合宿主的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2 ，ACE2)，从而介导病毒包膜与细胞膜融合，让病毒入侵细胞。
既然病毒进入宿主细胞才能复制增殖，而进入细胞的关键就是spike蛋白，如果其他病毒有相似的spike蛋白，那么他们可能就有一定的关系。
通过比对进入细胞的钥匙——Spike蛋白的基因序列，科学家们就能更准确地找到新冠病毒可能的“近亲”。
科学家们使用的“武器”——大数据，其实就是前文提到的宏基因组数据库。
宏基因组是指一个特定样品中所有物种的基因组，不局限于人体，也有动物，植物和土壤等等。这就好像一个大锅炖，把所有的基因序列全部测了，之后再分析里面具体有什么。
这次新冠病毒的发现，最早也是基于宏基因组，利用mNGS技术组装出病毒的基因组草图才能最终确定其身份。
同样地，为了找到新冠病毒的“近亲”，科研人员于一月初通过深度测序，组装出新冠病毒的精确基因组序列。但是可供参考的宏基因组中，基因序列都是草图，大多都是不完整的小片段，难以直接进行比对。
令人庆幸的是，在2019年10月，来自广东应用生物资源研究所的科研人员发表了一篇题为Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)的论文。文章中发布了其组装的马来西亚穿山甲体内的病毒宏基因组草图。
虽然草图中不会包含所有得到的基因序列，但很幸运的包含了Spike蛋白的RBD（受体结合结构域）。
由于已知新冠病毒的受体蛋白ACE2主要在肺中表达，有人就利用来自穿山甲肺部的宏基因组序列，结合VirMAP软件，组装出穿山甲肺部冠状病毒的基因组草图；并惊奇地发现部分序列和新冠病毒的S蛋白基因序列高度相似，不管是从序列比对、系统关系还是蛋白结构都非常相似。
那么，基于此我们能不能说穿山甲就是中间宿主呢？
答案依旧是否定的。
一方面我们不知道穿山甲冠状病毒的全基因组序列，仅仅通过RBD结构域的分析还十分有限；
另一方面缺少流行病学的证据，无法进行因果分析。
只不过最近又出现了一些相关文献的报道，似乎能为这个假说提供更多证据。
Matthew C. Wong和Lamia Wahba等人都在预印本平台BioRxiv上发布文章，讨论了基于病毒宏基因组比对到穿山甲冠状病毒的RBD结构域序列，但仍然存在一定的局限性。
其中线越靠上说明和新冠病毒越相似，大体上蓝色最相似，但是聚焦到spike蛋白的RBD区域时却是穿山甲更相似，这里也是人们关注的地方。
而关于穿山甲体内的冠状病毒，也开始了此前尚未成功的湿实验验证。
2020年2月中旬，香港大学的管轶教授和广西医科大学的胡艳玲老师等人合作，基于前面的大数据研究基础，收集了广西海关查获的18个冷冻穿山甲组织样品。在肠和肺的混合样品中，成功分离出冠状病毒。
作者组装出穿山甲冠状病毒的基因组草图，通过构建系统发生树，发现该冠状病毒与SARS病毒具有很高的同源性。
但是其与新冠病毒的同源性不如RaTG13-CoV。
针对RBD结构域的分析也得到了类似的结果。
特别值得注意的是，新冠病毒和广东来源的穿山甲的受体结合结构域之间氨基酸序列的相似性高达97.4%。
只是不知道这批穿山甲和Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)文献中的是不是同一批。
有意思的是，几乎在同一天，华南农业大学的科研人员也在GISAID数据库中上传了穿山甲冠状病毒的基因组数据。
系统发生树分析显示出与管轶教授类似的结果：总体和现在的新冠病毒很像，但还是不如RaTG13-CoV相似性高。
最后我们做个简单总结：
基于病毒宏基因组的数据、荧光定量PCR、分离纯化病毒并培养等实验结果，我们可以确认在穿山甲中存在冠状病毒，且该冠状病毒的基因组与新冠病毒高度相似。
尽管两者总体相似性在85.5%-92.4%，但是来源于广东的穿山甲的冠状病毒的RBD结构域与新冠病毒相似度高达97.2%，是高于蝙蝠冠状病毒RaTG13-CoV的。
但是，目前还未发现任何来自潜在中间寄主的冠状病毒，相较于蝙蝠来源的RaTG13-CoV，和新冠病毒基因组的整体更加相似。
而出现局部RBD的结构域相似度更高，也可能是因为趋同演化的原因，并不能说明广东来源的穿山甲冠状病毒与新冠病毒有最近的亲缘关系。
换句话说，就是穿山甲可能是新冠病毒的潜在中间宿主，但还不能确认是中间宿主。
最后十分期待华南农业大学关于穿山甲为新冠病毒中间宿主的论文，也期待科学家们对于病毒来源的问题有更进一步的探究结果。
参考文献：
[1] http://www.nature.com/articles/s41586-020-2012-7_reference.pdf
[2] Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica)
[3] Evidence of recombination in coronaviruses implicating pangolin origins of nCoV-2019 Matthew C. Wong, Sara J. Javornik Cregeen, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino bioRxiv 2020.02.07.939207; doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.07.939207
[4]Identification of a pangolin niche for a 2019-nCoV-like coronavirus through an extensive meta-metagenomic search Lamia Wahba, Nimit Jain, Andrew Z Fire, Massa J Shoura, Karen L Artiles, Matthew J McCoy, Dae Eun Jeong bioRxiv 2020.02.08.939660; doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.08.939660
[5]Identification of 2019-nCoV related coronaviruses in Malayan pangolins in southern China Tommy Tsan-Yuk Lam, Marcus Ho-Hin Shum, Hua-Chen Zhu, Yi-Gang Tong, Xue-Bing Ni, Yun-Shi Liao, Wei Wei, William Yiu-Man Cheung, Wen-Juan Li, Lian-Feng Li, Gabriel M Leung, Edward C Holmes, Yan-Ling Hu, Yi Guan bioRxiv 2020.02.13.945485; doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.13.945485
[6] 《管轶教授口述：2003年港大实验室是如何锁定SARS源头的？》，三联生活周刊，2013年第10期
[7] http://virological.org/t/ncov-
