新方法可以这样来研究星形胶质细胞-小胶质细胞相互作用机制
中枢神经系统中的细胞间相互作用在神经系统疾病中起着重要作用。然而，对所涉及的特定分子途径知之甚少，其系统鉴定方法也有限。在CNS驻留的胶质细胞的异常相互作用会导致几种神经系统疾病，如多发性硬化（MS）和实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用有可能确定神经系统疾病的候选治疗靶点。然而，目前的方法没有将细胞间相互作用与分子状态的因果联系起来，因此亟需有效的方法来检测由表面或分泌因子介导的短暂细胞间相互作用。
正向遗传筛选平台，如基于CRISPR-Cas9系统的平台，是识别控制感兴趣生物过程基因的有力工具。然而，由于无法通过高通量共培养和受干扰单细胞的筛选，限制了其应用。研究细胞通讯的正向遗传筛选平台需要在受控微环境中建立由表面或分泌因子介导的细胞间相互作用。它还需要检测由这些相互作用产生的现象，以及表型与特定CRISPR-Cas9诱导之间的关联。
近日，美国波士顿哈佛医学院布里格姆妇女医院Francisco J. Quintana教授研究团队在Science发表研究，该团队开发了一个正向遗传筛选平台（SPEAC-seq），该平台结合了CRISPR-Cas9干扰、皮升微滴中的细胞共培养和基于微流体的荧光激活微滴分选，可以确定细胞与细胞间的通信机制。
1. 基于微滴的正向遗传细胞间相互作用筛选平台的开发
首先，使用两种水性悬浮液（每种细胞类型一种）和油的微流体共流用于产生皮升的含有细胞对的油包水液滴，并通过使用定制的三色光学系统和介电泳微流体分选机进行检测和分选[Fig.1B,C]。同时，开发并验证了一种用于加载和检测微滴中细胞对的系统，该系统使用细胞渗透荧光染料进行多重标记[Fig.1D,E]。总的来说，研究人员初步建立了用于研究细胞-细胞相互作用的微滴微流体平台。
Figure 1 皮升液滴容器中细胞间相互作用的检测
2. SPEAC测序鉴定星形胶质细胞和小胶质细胞相互作用的信号传导
接下来，基于微滴的共培养系统与CRISPR-Cas9干扰相结合，建立了SPEAC-seq，这是一个用于调控细胞间相互作用的正向遗传筛选平台。并基于此来鉴定参与抑制星形胶质细胞中NF-kB活化的小胶质细胞因子[Fig.2A-C]。
Figure 2 SPEAC seq确定了限制星形胶质细胞促炎反应的小胶质细胞因子
为了关注参与控制细胞-细胞间通信调节途径的候选蛋白，研究人员鉴定了小胶质细胞表达的四种候选生长因子（Areg、Nrtn、Fgl1和Pnoc），它们通过星形胶质细胞表达的四种独立受体（表皮生长因子受体[Egfr]、Lag3、Gfra2、Oprl1）发出信号[Fig.2H,I]。
为了进一步评估SPEAC-seq揭示的每个候选途径在炎症中的调节作用，应用了细胞类型特异性的体内Perturb-seq方法。在EAE模型中发现，Egfr靶向导致IL-1b/TNFa信号的激活最强，其促进与EAE和MS相关的NF-kB驱动的星形胶质细胞反应。SPEAC-seq鉴定的EGFR配体是Areg，它编码双调节蛋白（amphiregulin）。总之，小胶质细胞分泌的AREG通过星胶EGFR受体抑制星胶的促炎反应[Fig.3]。
Figure 3 小胶质细胞AREG限制星形胶质细胞的促炎反应
3. 星形胶质细胞衍生的IL-33诱导ST2+小胶质细胞AREG表达
最后，研究人员探索在EAE期间诱导小胶质细胞Areg表达的CNS病理学原因。已有研究确定IL-33是EAE的抑制剂和Areg表达的诱导剂。重新分析RABID seq数据确定星形胶质细胞触发的IL-33信号传导是EAE期间Areg+小胶质细胞的假定上游调节因子。表明星形胶质细胞产生的IL-33诱导小胶质细胞表达Areg，然后作用于星形胶质细胞以抑制疾病促进反应，这是一个负反馈调节[Fig.4]。
总之，这些发现确定了一个由双调节蛋白和IL-33-ST2（IL-33受体）信号传导介导的负反馈调节，这限制了EAE中由小胶质细胞-星形胶质细胞相互作用驱动的CNS病理。
Figure 4 IL-33-ST2信号控制星形胶质细胞-小胶质细胞调节回路
总结与展望
本文中报告了SPEAC-seq的开发，这是一个基于微流体、微滴中的细胞共培养、CRISPR-Cas9基因干扰和微滴分选的平台，该平台能够实现识别细胞通信机制的正向遗传筛选。研究人员使用SPEAC-seq，结合体内遗传干扰，在EAE模型和临床样本中，确定了小胶质细胞产生的双调节蛋白作为疾病促进星形胶质细胞反应的抑制剂。
本研究开发了一种定义细胞-细胞通讯分子机制的新方法，并将IL-33-ST2信号确定为小胶质细胞-星形胶质细胞中限制CNS病理的回路。
在未来的应用中，SPEAC-seq可以与表观基因组或转录组的全基因组分析相结合，以研究它们通过细胞-细胞相互作用的调节，或者与抗体或小分子条形码库相结合，识别细胞-细胞通信的治疗调节剂，具有重要价值和广阔的前景。
参考文献：
Wheeler, Michael A et al. “Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk.”Science (New York, N.Y.) vol. 379,6636 (2023): 1023-1030. doi:10.1126/science.abq4822
编译作者：Young（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）
