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Identification of Molecular Subtypes and a Prognostic Signature Based on Inflammation-Related Genes in Colon Adenocarcinoma
Chenjie Qiu, 1 , † Wenxiang Shi, 2 , † Huili Wu, 3 , † Shenshan Zou, 1 Jianchao Li, 1 Dong Wang, 1 Guangli Liu, 1 Zhenbiao Song, 1 Xintao Xu, 1 Jiandong Hu,
摘要：
肿瘤浸润免疫细胞和可介导免疫浸润的炎症相关基因都有助于结肠癌患者的发生和预后。在这项研究中，我们开发了一种方法来预测结肠癌患者的生存结果以及直接免疫疗法和化学疗法。我们从癌症基因组图谱 (TCGA) 获得患者数据，并从 GeneCards 数据库中捕获炎症相关基因。“ConsensusClusterPlus”包用于根据通过差异表达分析和单变量Cox分析获得的炎症相关基因生成分子亚型。还构建了包括四个基因（PLCG2、TIMP1、BDNF 和 IL13）的预后特征，并且是独立的预后因素。集群 2 和更高的风险评分意味着更差的总体存活率以及人类白细胞抗原和免疫检查点的更高表达。还根据炎症相关分子亚型和风险特征比较了通过估计、CIBERSORT、TIMER、ssGSEA 算法、肿瘤免疫功能障碍和排除 (TIDE) 和肿瘤干性指数 (TSI) 计算的免疫细胞浸润。此外，基于风险特征进行分层、体细胞突变、列线图构建、化疗反应预测和小分子药物预测的分析。我们最终使用qRT-PCR检测了结肠癌细胞系中四个基因的表达水平，并获得了与预测一致的结果。
结果
基于GeneCards数据库，获得357个炎症相关基因，筛选标准为蛋白质编码基因，相关性得分大于5。本研究的主要流程见。随后，通过对COAD和正常结肠组织的差异分析，获得了66个上调基因和54个下调基因。 。GO和KEGG通路富集分析表明，上述差异表达基因主要富集在免疫、炎症、细胞因子-细胞因子受体和肿瘤相关的生物学功能和信号通路中。此外，还显示了前 10 个上调和下调基因之间的相关性。使用 STRING 数据库探索 PPI 网络并使用 Cytoscape 进行可视化。排名前十的hub基因通过度数排序得到。
(A) COAD 中 66 个上调和 54 个下调 IRG 的火山图（FDR < 0.05 和 |logFC| > 1）。(B)正常结肠和 COAD 组织之间 120 个 DE-IRG 的热图。(C) GO 分析中的前十个丰富术语属于 DE-IRG 的 BP、CC 和 MF。(D) KEGG 分析中的前 30 个丰富术语。(E)前十名上调和下调的 IRGs 之间的相关性。(F)根据 STRING 数据库的 DE-IRG 的 PPI 网络。(G)从“cytohubba”插件获得的中枢基因。（你好）从“MCODE”插件获得的两个模块。IRGs，炎症相关基因；COAD，结肠腺癌；FDR，错误发现率；FC，倍数变化；DE-IRGs，差异表达的 IRGs；GO，基因本体论；BP，生物过程；CC，单元组件；MF，分子功能；KEGG，京都基因和基因组百科全书；PPI，蛋白质-蛋白质相互作用。炎症相关簇的鉴定以及簇与肿瘤免疫微环境、肿瘤发生评分和 TSI 之间的相关性分析
通过单因素 Cox 分析，我们获得了 10 个与预后相关的基因，其中 IL13 是保护因素，其他 9 个基因是危险因素相关分析表明，大多数基因相互关联。十个预后相关基因进一步用于聚类分析。COAD患者聚类成两个亚组时聚类效果最好，亚组内部一致性和稳定性较好。生存分析显示集群 1 的预后优于集群 2。热图揭示了2个簇之间的基因表达差异，并与临床病理参数如分期、T分期和N分期显着相关。
随后，各种算法被用来分析两个集群之间免疫浸润的差异。我们发现两个集群之间的免疫细胞和免疫相关功能或途径存在显着差异。TIMER 算法显示，Cluster 2 与更多的免疫细胞浸润有关，例如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。CIBERSORT 算法揭示了类似的结果（。ESITIMATE 算法显示，Cluster 2 具有较高的免疫评分、基质评分、ESITIMATE 评分和较低的肿瘤纯度。我们还发现簇 2 与许多 MHC 分子的高表达有关。
此外，Cluster 2 中的血管生成活性、间充质 EMT、致瘤细胞因子和干性评分显着更高。桂等人。发现缺氧免疫风险评分与 EREG-mRNAsi 和 ENHsi 呈负相关。较高的 EREG-mRNAsi 和 ENHsi 水平意味着更好的预后 ( 10 )。在这项研究中，发现集群 2 与较低的 TSI 相关。
因为这两个集群在免疫浸润方面存在显着差异，我们评估了与五个常见免疫检查点的相关性。簇 2 的 PD-L1、CTLA4、HAVCR2、LAG3 和 PD1 表达较高。集群 2 与更高的 TIDE 评分相关。
(A)通过单变量 Cox 分析得出的十个与预后相关的 DE-IRG 的森林图。(B)十个基因之间的相关性。(C) k = 2 时的共识聚类矩阵。(D) k 值为 2 至 9 的共识聚类 CDF。(E) k = 2 时 CDF 曲线下面积的相对变化。(F)聚类间生存差异的 KM 曲线1和簇2。（G）两个簇之间的十个基因的热图以及簇和临床参数的相关性。使用 CIBERSORT (H)进行免疫细胞浸润，使用 ESTIMATE (I)进行免疫和基质评分，MHC 分子的表达(J)、血管生成活性、间充质-EMT、致瘤细胞因子和干性评分（K）、五种常见免疫抑制剂（L）和两个集群之间的TIDE评分（M） 。构建炎症相关签名和基于签名的列线图
(A)通过多变量 Cox 分析在签名中选择的四个基因的森林图。(B)签名中包含的四个基因的系数。(C)签名与四个基因之间的相关性。(D)四种基因表达水平与临床病理学特征之间关联的热图。TCGA 队列(E)和GSE17538队列(F)中的生存分析、热图、生存状态以及风险评分和 ROC 分析。根据单变量(G)和多变量 Cox 分析(H) ，该特征是 TCGA 队列中 COAD 患者的独立危险因素. 根据临床病理特征，如集群（I）、肿瘤分期（J）、淋巴结状态（K）和转移（L） ，不同组之间风险评分的差异。(M)基于风险评分和年龄的列线图。(N)用于预测 3.5 年、5 年和 7.5 年生存概率的列线图的校准图。ROC，接收器操作特性；TCGA，癌症基因组图谱。根据签名估计肿瘤免疫细胞浸润和免疫检查点抑制剂
(A)与肿瘤发展和进展相关的途径在高危人群中丰富。(B) JAK-STAT 信号通路是高危组中最相关的 KEGG 通路。(C)与免疫、趋化因子和 MHC 分子相关的多重途径在高风险组中富集。免疫细胞浸润和免疫相关功能或途径(D)、免疫和基质评分(E)、免疫细胞浸润使用 TIMER (F)和 CIBERSORT (G)、MHC 分子表达水平(H)、五种常见免疫抑制剂(I)和潮汐分数(J)在高风险和低风险人群之间。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不显着）。(A)与肿瘤发展和进展相关的途径在高危人群中丰富。(B) JAK-STAT 信号通路是高危组中最相关的 KEGG 通路。(C)与免疫、趋化因子和 MHC 分子相关的多重途径在高风险组中富集。免疫细胞浸润和免疫相关功能或途径(D)、免疫和基质评分(E)、免疫细胞浸润使用 TIMER (F)和 CIBERSORT (G)、MHC 分子表达水平(H)、五种常见免疫抑制剂(I)和潮汐分数(J)在高风险和低风险人群之间。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不显着）。血管生成活性、间充质 EMT、致瘤细胞因子、干性评分和 TSI 与签名的相关性
(A)与血管生成、EMT、细胞因子-细胞因子受体相互作用和干性相关的通路在高危人群中富集。(B)高危组和低危组之间血管生成活性、间充质-EMT、致瘤细胞因子和干性评分的差异。(C)风险评分与血管生成活性、间充质-EMT、致瘤细胞因子和干性评分的相关性。(D)两组间 TSI 的差异。TSI，肿瘤干性指数。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不显着）。
高危组（A）和低危组（B）体细胞突变的瀑布图。高风险组(C)和低风险组(D)中不同突变基因的共现和互斥突变的热图。*p < 0.01。(E)高风险组和低风险组之间的 TMB 比较。(F)高 TMB 组和低 TMB 组之间的总生存期差异。(G)基于 TMB 和风险评分的总生存期差异。(H)来自 cBioPortal 数据库的 COAD 患者中四种基因（TIMP1、IL13、PLCG2、BDNF）的突变率。（ns，不显着）。
(A)高危组和低危组常用化疗药物化疗反应的差异。(B)高风险组和低风险组之间的差异表达基因。(C)从 cMap 数据库中筛选出的六种潜在靶标药物的 3D 结构。（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；NS，不显着）。PLCG2、TIMP1、BDNF和IL13在不同结肠癌细胞系中的表达
通过qRT-测量不同细胞系（NCM460、HCT116、SW480、HT29、LOVO、RKO、DLD-1）中TIMP1 （A）、IL13 （B）、BDNF （C）和PLCG2 （D）的mRNA表达水平聚合酶链反应。将结果标准化为参考基因 GAPDH。数据显示为平均值±SEM，双尾非配对t检验用于每个标记的统计计算，n = 3个独立实验。（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，不显着）。结论
总之，本研究根据结肠癌中的 IRGs 确定了分子亚型，并使用 IRGs 构建了预后特征。还分析了不同分子亚型和不同风险组之间的免疫情况、基因突变状态和药物敏感性。该签名可能为临床判断预后和药物治疗提供证据。
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