3+单基因肿瘤+预后

1. 差异表达的 TILRGs

在这项调查中，共发现了1555个 TILRG。图1a 显示了前50个实质上相关的基因。在差异表达分析后，311个 DETILRG 因此被筛选(图1b)。GO 和 KEGG 分析的结果如图1c-f 所示。

图1 肿瘤浸润淋巴细胞相关基因的鉴定

2.基因模型的建立与验证

通过单因素Cox回归分析，训练组共发现15个预后相关TILRG（图2a），包括 2 个保护因素（ANKRD44、SNAI3）和 13 个危险因素（RGS2、ACTN1、EFEMP1、CCDC80、GAS7、TGFB3、NRP2、FBN1、IGF1、ADAMTSL1、EDNRA、ADAMTS12 和 ATP8B2）。而网络图显示这些等级的 TILRG 的表达水平之间的关系要清晰得多（图2）作者进一步研究了这些TILRG在染色体上的位置以及它们是如何改变的（图2c，d）。根据研究结果，ATP8B2最显着的改变“增益”是在1号染色体上发现的，而NRP2的主要改变“损失”是在2号染色体上发现的。与TCGA BCa数据集中的其他TILRG相比，FBN1更常发生突变，根据这15个TILRG的突变和变化的oncoplot瀑布图（图2）。此外，图2f表明只有几个基因同时被改变。随后，利用LASSO方法减少了潜在TILRG和LASSO回归曲线的列表（图3a） 和交叉验证图（图3b） 获得。接下来，使用套索和多元Cox分析鉴定了五个轮毂TILRG（图3）。患者被分为高TILRG和低TILRG组。使用风险评分的中值作为阈值，更好地检查风险特征的预后意义。作者发现，在TCGA训练，TCGA测试，TCGAall和GEO测试队列中，高TILRGs亚组的OS比低TILRGs亚组短得多（图3d-g）。在TCGA培训队列中，1年，3年和5年OS的AUC分别为0.742,0.718和0.723（图3）。在TCGA测试队列中分别为0.706、0.661和0.668（图3i），以及整个TCGA队列中的0.733、0.705和0.697（图3j），以及GEO测试队列中的0.681、0.670和0.646（图3）。此外，作者发现高TILRG亚组的死亡患者比例高于低TILRG亚组（图3L-O）。

图2 通过单变量Cox回归分析，15个TILRG与训练队列的预后显著相关

图3 肿瘤浸润淋巴细胞相关基因标记的开发和验证

3.TILRGS 的临床应用价值评价

根据作者的研究结果，风险评分是 OS 的独立预测因子(图4a，b)。此外，在整个 TCGA 队列中，1年、3年和5年 OS 风险评分的 AUC 值显著大于其他临床变量的 AUC 值(图4c-e)。然后，作者创建了一个列线图来预测 BCa 的总生存期(图4f)。透过校正图及 ROC 曲线，列线图的预测与实际观测概率显示出极佳的一致性和准确性(图4g，h)。作者发现在整个 TCGA 队列中，除了性别之外，风险评分和临床特征之间存在显著的相关性(图5a)。临床特征，包括年龄，病理分级，临床肿瘤分期和 TNM 状态，与风险评分高度相关(图5b)。然而，男性和女性之间的风险评分在统计学上没有显著差异。然后，根据年龄(> 65岁和 < = 65岁)、性别(男性和女性)、肿瘤分级(高级和低级)、病理 M 期(M0和 M1)、病理 N 期(N0和 N1-3)、 T 期(T0-2和 T3-4)和病理分期(I-II 和 III-IV)将 BCa 患者分为不同组进行进一步的生存分析。在大多数分层类别中，两个风险组之间存在显著差异，表明低风险组有较长的 OS (图5c)。

图4 生存预测列线图的建立与评价

图5 基因标记与TCGA数据集中BCa患者的临床病理学特征相关

4.基于 TILRGS 的功能分析

在这里，在各个TILRGS子组之间发现了305个DEG。对上述DEG进行的GO和KEGG分析的结果如图所示。6一、二.GSEA发现，高TILRGS亚组富含致心律失常性右室心肌病、扩张型心肌病、局灶性粘连、肥厚型心肌病和肌动蛋白细胞骨架调节（图6c），而低TILRGS亚组在同种异体移植排斥，抗原处理和呈递，用于IgA产生的肠道免疫网络，嗅觉转导和原发性免疫缺陷方面富集（图6）。GSVA富集分析显示，两个TILRGS亚组之间的富集途径不同（图6e)。

图6 基于高风险和低风险组之间的差异表达基因的功能分析

5.BCa中各种TILRGS组的免疫景观

作者使用各种免疫评估算法来检查BCa患者两个风险组的免疫状态（图7）。根据ESTIMATE结果，低TILRGS亚组的免疫评分高于高TILRGS亚组（图7）。如图所示。7c.低TILRGS亚组的CD8 T细胞，记忆激活的CD4 T细胞和滤泡辅助性T细胞的比例高于高TILRGS亚组。而高TILRGS亚组的M0和M2巨噬细胞分数高于低TILRGS亚组。此外，作者发现低TILRGS亚组在细胞溶解活性，HLA，炎症促进和T细胞共刺激方面的得分高于高TILRGS亚组（图7d).

图7 不同风险亚组间肿瘤免疫微环境特征

6.各种风险群体的免疫治疗反应

在目前的研究中，作者评估了几种化疗药物对各种风险组的IC50值。结果显示，达沙替尼、多西他赛、伊马替尼和帕唑帕尼在高TILRGS亚组中的IC50值低于低TILRGS亚组（图8a），这意味着高TILRGS亚组的患者可以从上述化疗中获益更多，而吉非替尼，博舒替尼，吉西他滨和甲氨蝶呤的IC50值在低TILRGS亚组中较低（图8b），表明低TILRGS亚组的患者可以从上述化疗中获得更多益处。在这项研究中，作者旨在评估作者的工作确定的枢纽TILRG是否是用作治疗靶点的可行候选者。通过CellMiner数据库，作者检查了许多已获得FDA批准或正在临床试验中的物质的药物敏感性。图中显示了 20 个最重要的相关性。此外，TCIA结果显示，与高TILRGS亚组相比，低TILRGS亚组具有更高的TCIA评分（图8d），表明这些患者可能受益于抗CTLA4和抗PD-1治疗效力增加的免疫治疗。

图8 评估药物敏感性和免疫治疗

7.关键基因的单细胞分析

为了研究膀胱癌（BCa）TME中关键基因的表达，作者对GSE130001从TISCH数据库获得的数据集。如图所示。图9，EFEMP1和ATP8B2主要在内皮细胞中表达;ANKRD44和SNAI3主要在上皮细胞中观察到;而IGF1主要见于肌成纤维细胞。

图9 关键基因的单细胞分析

8.亚型的鉴定及其与BCa临床结果和肿瘤免疫的关系

使用无监督共识分析将所有TCGA BCa患者分为两个不同的亚型（图10）。根据作者的研究结果，第2类患者（n = 216）在总生存率方面优于第1类患者（n = 188）（图10）。与聚类1相比，聚类2显示出死亡率和更高的风险评分（图10c，d）。在TCGA BCa数据集中，作者发现不同亚型与性别、病理分级、临床分期、T分期和N分期之间存在实质性关系（图10）。与第1类相比，第1类女性、高级别、III-IV期、N3-3期和T4-2期患者比例更大（图10）。接下来，作者使用不同的免疫评估算法检查了两个集群中的免疫景观（图11）。根据ESTIMATE结果，第1亚型的免疫评分高于第2亚型（图11）。CIBERSORT算法的结果表明，与亚型2相比，亚型1表现出更高的记忆激活CD4 T细胞，滤泡辅助性T细胞，M2巨噬细胞，活化的树突状细胞和静息肥大细胞的水平（图11）。进一步的分析表明，就所有1个免疫相关途径而言，聚类2优于聚类13（图11d）。

图10 TCGA数据集中签名中的五个基因的聚类分析

图11 不同亚型间肿瘤免疫微环境特征

总结

目前的研究包含几个缺点。首先，使用来自TCGA和GEO数据库的追溯数据，建立并验证了基因标记。为了评估其疗效和可行性，需要进行额外的大规模前瞻性临床研究。此外，需要更多精心策划的基础研究试验，以强调TILRG在BCa的出现和发展中发挥的关键作用。总之，目前的工作开发了一种基于TILRG的基因标记，可用作BCa患者预后和免疫治疗反应的有用预测因子。