组培生产工作中常遇到的问题

1、培养基的配制注意事项

植物组织培养最常用到 MS 培养基，包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，所以准备 MS 培养基需要配制多种高倍母液。配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分。切记“一锅煮”，即不能将各种化合物一齐添加进去。

2、灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软

植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感，pH 值低于 5 很难成胶或凝胶偏软，切记高压灭菌前调节培养基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求，也就是相对于 MS 培养基，1 / 2 MS 培养基中植物凝胶要适当增加用量。另外灭菌后，倒出培养基前一定将培养基摇匀（带防烫手套），因为琼脂密度大底层含量高，容易造成培养基强度不均匀。

3、水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用过程中有何区别？

水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，酶解更有利于发挥其作用。

4、如何溶解组培常用植物激素？

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液。如有结晶析出，可考虑用 1 / 10 体积的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于碱性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的浓度。

5、细胞分裂素的使用浓度

一般情况下在培养基中加入 0.1～10.0 mg/L 的细胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多数用 1.0～2.0 mg/L；KT 浓度为 0.5～2 mg/L，此数据也要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。

6、哪些植物激素能高压灭菌，哪些不能高压灭菌？

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高温高压灭菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌，否则会分解失效。该类植物激素配制母液后需用 0.22ul 微孔滤膜过滤除菌，待培养基冷却（50 - 60℃）后尚未凝胶前加入混匀。

7、培养基的 pH 值对凝胶硬度有无影响？

有影响。若将培养基 pH 值调的过高（大于 6），则培养基偏硬，增加接种的阻力，会对外植体造成损伤。若将培养基 pH 值调的过低（小于 4.5），则培养基不能凝固，起不到固定外植体的作用。一般将培养基的 pH 调节至 5.5～6.0 为宜。

8、灭菌过程是否影响培养基的 pH 值？

培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化，培养基 pH 值灭菌后会有所下降，灭菌前培养基的 pH 值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。

9、 用75%的酒精进行种子消毒需要注意的问题

种子在消毒过程中使用75%的酒精应慎重，酒精渗透力极强，消毒时间过长会直接影响种子发芽率，所以消毒时间不应超过 1 min。

10、原始繁殖材料的消毒

组培生产中，作为原始繁殖材料的外植体消毒直接影响整个培养过程的进行。从室外采回来的外植体需要进行消毒，首先用自来水冲洗外植体，冲洗时间可根据采集部位不同而定，一般在 5～15 分钟即可；在超净台中进行药剂的处理是关键，常用的药剂处理有70%的乙醇溶液、9%的次氯酸钠溶液和0.1～0.2%的升汞溶液，具体可根据实验材料而定。但要注意的是经生汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗 6～8 次。

11、应对植物组织培养过程中出现的污染

植物组织培养过程中的污染来源主要分为 三种：真菌、细菌、组织培养过程中的污染源。在操作过程中，难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。另外，不正确操作也会增加污染几率。

预防措施：通风，保持室内空气干燥，紫外杀菌等；污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。

污染原因

培养基污染 ：若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染。比如：培养基灭菌不彻底，开瓶时间过长，灭菌后存放时间过长等；高温蒸汽灭菌器的温度、压力、时间没有正确设置；灭菌过程中滤膜孔径选择、过滤灭菌器的灭菌处理、过滤灭菌操作等。

这些均会影响培养基的灭菌效果。

措施：严格按照实验要求，灭菌规程操作。

外植体污染 ：若污染菌类是从材料周围长起，且发生在 5 天以后，则说明是材料带的内生菌。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因可能是未剪去两个切口或者虽剪去切口但是所用器具带菌；或者是未及时发现污染苗，接种过程中引起交叉污染；

措施：取材时应仔细选择，以减少污染的发生。

操作环节污染 ：接种室是否清洁、干燥、密封，是否经常用紫外灯照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精喷雾杀菌等；超净工作台摆放物品杂乱，长时间不换滤网，导致净化能力降低；接种用具灭菌不彻底引起污染；操作不正确等。

措施：每次接种前半个小时，用20%的新洁尔擦洗室内设备、工作台面，再用紫外灯照射20 min。还可以喷洒70%的乙醇进行消毒。除了培养基、接种材料、器具和用具保证无菌外，同时在接种时还需要严格进行无菌操作。

真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉；若是细菌污染，只要及时发现，将材料上部未感染菌的部分剪下转接，材料仍可以用。

用抗生素等杀菌药剂处理。至今还未发现哪种抗生素能够对各种菌都有效，并且抗生素也会影响植物材料的正常生长分化。一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。

12、外植体的选择

为了使接种后的诱导得以成功，选的外植体应该是幼嫩的，处于生长旺盛时期的，并且外植体的体积不能过小，如若过小则会影响愈伤组织的形成，从而影响进一步的分化。因此，一般接种的外植体体积在 0.5～1.0 cm2 的范围内即可。最适的为茎尖、带芽茎段，也可以利用叶子、子叶、根段、花器官组织等。

13、植物茎段组织培养需要注意哪些问题

以茎段进行组织培养比较容易，一般取植物的嫩茎切段作为外植体，切成 0.5～1 cm 长的小段进行接种，保证每个茎段有一个芽点和一片叶子，将芽点部位以下垂直插入培养基凝胶中进行生根培养。

14、外植体接种需要注意的操作事项

接种前首先进行灭菌消毒，接种所用的镊子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高温高压灭菌，提前20分钟打开超净工作台，紫外灯灭菌15～20min，操作人员要用 75% 的酒精擦手、工作台和器皿、解剖刀和镊子等，并擦酒精灼烧晾凉后备用。在无菌培养皿中或滤纸上切割外植体，接种到培养基表面，瓶口倾斜接近酒精灯火焰。

15、组织培养中材料褐化现象

不同品种以及生理状态引起的褐化状态不同。培养基过高浓度的无机盐及细胞分裂素会使褐化现象加重。培养条件不当，例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加重外植体的褐变程度。

防治措施：

选择合适的外植体：处于生长旺盛的外植体，可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件、无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

使用抗氧化剂：在培养基中使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP 等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。使用 0.1%～0.5% 的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

连续转移：对容易褐变的材料可间隔12～24小时培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

16、 材料玻璃化问题

植物材料不断进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状、水迹状，这种现象通常称为玻璃化。玻璃化是试管苗的生理失调症，试管苗生长缓慢、玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，繁殖系数有所下降。当培养基上细胞分裂素水平较高时，容易出现玻璃化现象。

愈伤组织的玻璃化问题主要表现在培养过程中愈伤组织松散，脆易碎。叶子或是长出的愈伤，一段时间后在其周围出现水渍化，继而影响整个培养基。

防治措施：在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，降低培养基中细胞分裂素含量及含氮化合物的用量，选用低 NH4 +水平的 B5 培养基，都能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生；增加光照，对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；在培养基中添加活性炭、马铃薯汁、间苯三酚等可有效的减轻和防止玻璃化。

17、材料水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯

可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。

改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。

18、材料长期培养几乎无反应

可能原因：培养基不适合，生长素的选择和用量不当；植物激素对生长发育和生理过程的调节作用，往往不是某一种植物激素的单独效果。环境温度不适宜。

改进措施：更换培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度；调整激素的种类与配比，增加生长素用量。例如使用人工合成的生长素类似物 2，4 -D 等可有效促进细胞分裂和伸长，新器官的分化和形成；调整培养温度等环境条件。

19、愈伤组织生长过旺疏松

可能原因：由于培养基中激素添加过量，培养室温度偏高，矿物质等无机盐含量不当等因素引起的。

改进措施：根据不同的品种、不同组织、不同器官，应适当减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度，避免愈伤组织生长过旺和疏松现象发生。

20、愈伤组织生长缓慢太紧密

可能原因：细胞分裂素和生长素的用量过多，糖浓度过高。

改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。

21、愈伤组织分化率低，畸形；分化出的芽多为叶状芽或丛芽；芽生长困难，不易成苗。培养时间长时，再次愈伤组织化。

可能原因：生长素用量偏高，温度偏高。

改进措施：减少生长素用量，可以通过分化培养时在培养基中添加 GA3（浓度在 0.5～2 mg/L之间）解决，并适当降低愈伤组织的培养温度。

22、丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽

可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，产生过多的不定芽；温度过高，光照短，光强不足；不及时的转移和分切，生长空间小。

改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素；延长光照时间，增强光照；及时转接；降低接种密度；更换透气的封口膜等。

23、组织培养过程中出现黄化

引起原因：培养基中 Fe 的含量不足，各种矿质营养不均衡；培养环境通气不良，瓶内有害气体积累（乙烯、氨气、甲醛）等会引起植物材料黄化脱落；激素配比不当；糖用量不足或长时间不转移；pH 值变化过大；培养温度不适；光照不足等。

改进措施：改善组培条件，在配制培养基过程中检查仪器设备是否准确；降低组培苗的接种密度，及时转接培养物；使用透气的封口膜改善瓶内通气状况；适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度；控制培养室内温度，适当增加光照。

24、组培培养基都有哪些？

MS 培养基：1962年穆拉辛格和斯库格为烟草细胞培养而设计，其中硝酸盐的浓度高，适合植物原生质体、细胞和组织培养。

B5培养基：1968 年甘伯尔格为大豆细胞培养而设计，铵的浓度低。适合木本植物的组织和细胞培养。

富盐平衡培养基：是目前使用最广泛的一类。特点是：无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高；元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。

高硝态氮培养基：代表性培养基有 B5、N6、SH。特点是：硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（VB1）。

中盐培养基：大多是在 MS 培养基基础上进行改良设计。特点是：大量元素无机盐为 MS 的一半，微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比 MS 增多，例如增加了生物素、叶酸等。

低盐培养基：无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基。

25、木本植物（油料植物）组织培养中遇到再生苗无法生根时怎么办？

一般常用的1 / 2MS或者1 / 2WPM基本能够满足。如果增殖用的基本都生产正常，到生根的时候出现落叶，只能通过排除法一样样分析。首先看是不是培养温度太高，使用瓶盖后透气性差，导致乙烯积累。其次，可以适当添加少量分裂素，或者更换生长素，以及多种生长素混合使用。

26、培养基中添加糖类作为碳源物质，有何作用？

碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。

27、植物原生质体制备的材料及常用的渗透压调节剂

植物原生质体的材料需要选取生长旺盛的细胞，幼嫩的组织。无菌试管苗的叶片、胚轴及子叶、花药，以及愈伤组织（悬浮细胞）等。

常用的调节原生质体渗透压的稳定剂主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。渗透压浓度一般为0.3～0.8mol/L。

28、组培苗移栽需要注意的问题

移栽前打开组培瓶的封口膜，炼苗3～5d后取出小苗，用流水洗净根部的培养基，然后移栽到盛有灭过菌的蛭石的营养钵中过度一下，但不可直接向营养钵中浇营养液（容易长菌），用透明的塑料薄膜罩住小苗3～5d后移栽到土里。

29、光照强度是如何计算的

光照强度=光通量/单位面积。Lux的换算比较抽象，一般以烛光为计算单位。以现在所用的电源发光的光源，记作国际烛光，即25瓦特的电灯其光强度等于25国际烛光。1标准烛光 = 10.76 Lux。

30、LED光源在植物组织培养中的选择

光是植物生长中最重要的环境因子之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED 光源460nm左右的蓝光和660nm左右的红光是植物最需要的光波，对植物的生长发育起着关键性的作用。

如何提高组培苗的移栽成活率

试管苗本身的质量是决定移栽成活率的关键因素，因此培育壮苗是提高移栽成活率的主要措施。具体是在生根培养之前转入不含激素的MS培养基中进行壮苗培养后再转入生根培养基进行生根，或在生根培养基中加入一些植物生长延缓剂（如多效唑、B9等）来达到壮苗和生根的目的。

炼苗是组培过程中重要的一个环节，也是一个较为复杂的技术体系。提高炼苗成活率是决定组培成败和降低组培成本的关键。试管苗一般在高湿（100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒温（25℃）下培养，生长的植株有以下几个特点：

叶片无保护组织（角质层、蜡质、表皮毛等），细胞间隙大，气孔开张大，因此水分散失较快，易于萎蔫。无根毛或极少，并且有些从愈伤组织上发育的根与芽的疏导组织不相同，因此吸水能力较弱。

炼苗移栽时，环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大。具有以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能力不足，吸水量小于蒸腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。

空气温度上升比基质温度上升快，而根系的吸水能力在一定范围内与温度是成正比的。当气温升高，湿度较低时，叶片蒸腾急速增加，此时基质温度上不去，根系吸水能力不够，造成蒸腾大于吸水的失衡状，从而萎蔫死亡。

要获得高的炼苗成活率，一方面需提高出瓶苗的质量，提高其抗逆性。生根前的壮苗、理想的生根配方和培养环境的调控是关键；另一方面就是针对组培苗特点创造一个适宜的炼苗环境，保证空气湿度，平衡空气和基质的温度平衡关系并加强移栽后的管理：

光照：随苗的壮弱、喜光或喜阴而定，刚移栽后要有遮荫条件，根据苗的恢复和成活程度逐步增强光照。

温度：适宜的温度依植物种类而定，喜温植物以25ºC左右为宜，喜冷植物以18-20º为宜。温度过高，蒸腾作用加强，水分失衡，易造成死苗，而过低则幼苗生长迟缓，或不易成活。因此试管苗移栽的温室最好配备有控温设备，以保持试管苗移栽后温度不要变化太大。

水分：保持水分平衡和控制好湿度是试管苗移栽管理的核心。空气温度低，则试管苗容易萎焉；同时基质水分又不宜太多，基质水分过多，则透气不良，影响生根，容易导致烂苗致死.因此，需要在保证空气湿度足够大的同时，尽量确保移栽基质良好的透气状况。可采用微喷技术控制空气湿度或采用塑料小拱棚的办法来提高空气湿度，使试管苗叶面的蒸腾减少，使小苗始终保持挺拔的姿态，从而提高成活率。

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