IP （Immunoprecipitation）学习笔记

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）是一种通过与附着在可沉淀基质（磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物）上的特异性抗体结合来对抗原进行小型亲和纯化的方法。需要从细胞或组织裂解物中分离用于免疫印迹检测或其他检测技术的蛋白和其他生物分子时，免疫沉淀是最常用的方法之一。

原理：

Ⅰ 免疫沉淀由几个阶段组成：

1）细胞裂解：在存在或不存在去污剂的情况下通过裂解细胞来提取抗原。为了提高特异性，可以使用蛋白 A-琼脂糖珠预清除细胞裂解物。

2）抗体固定：将特异性抗体与蛋白A-琼脂糖珠结合。

3）抗原捕获：将细胞裂解中得到的抗原与抗体固定中得到的固定化抗体一起孵育，然后除去未结合蛋白质。

Ⅱ 免疫沉淀抗原可与抗体分离，并通过“免疫沉淀-重捕获”重新沉淀。该方案可用同一抗体进一步纯化抗原，也可用不同抗体来鉴定多亚基复合物的成分或研究蛋白-蛋白的相互作用。

1）抗原的解离和变性：用与蛋白A-琼脂糖珠结合的抗体1免疫沉淀的抗原在SDS和DTT存在下加热解离和变性。

2）二抗固定：抗体2与蛋白A -琼脂糖珠结合。

3）重捕获：变性抗原（条纹椭圆形）被与蛋白 A -琼脂糖珠结合的抗体2重新捕获；或者抗体1可以再次用于进一步纯化原始抗原（正方形）。

基本流程：

IP均需经过孵育、beads收集（离心或磁性装置）及溶液移除这三个步骤。最后一步的洗脱通常包括对用于SDS-PAGE的上样缓冲液中的beads进行加热，这可使蛋白质变性及发生不可修复性损伤。

预固定抗体IP中，特定蛋白的抗体（单克隆或多克隆）固定在不溶性支持物（如琼脂糖或磁珠）上，随后与含有目标蛋白的细胞裂解物一起孵育。在孵育期间，轻轻搅动裂解物使目标抗原结合到固定抗体上，形成抗原-抗体免疫复合物。随后，将免疫复合物从固相支持物上洗脱，进行目标抗原的性质分析。游离抗体IP中，将游离的未结合抗体加入裂解物中形成免疫复合物，然后利用填料回收复合物。

虽然预固定抗体法更常用于IP，但是如果目标蛋白浓度较低、抗体与抗原的结合亲和力较弱，则使用游离抗体形成免疫复合物的方法更好。

实验步骤：

1. 使用未标记抗体与琼脂糖颗粒

1.1. 一抗反应：在离心管中加入蛋白样品及一抗，置于旋转混匀器上4℃反应适宜时间。

1.2. 二抗反应：加入结合了二抗的琼脂糖颗粒，置于旋转混匀器上4℃反应适宜时间。

1.3. 洗涤：

（i）离心收集琼脂糖颗粒，除去上清（注意不要吸出琼脂糖颗粒）；

（ii）加入预冷的洗脱液或洗涤缓冲液，混匀后离心，除去上清（注意不要吸出琼脂糖颗粒），重复该步骤 3~4次；

（iii）加入SDS样品缓冲液，加热5分钟使目的蛋白从颗粒上分离，接着离心收集上清，收集的上清即可作为SDS-PAGE样品使用。

1.4. WB等后续操作

2. 使用标签抗体结合磁珠

2.1. input 样品制备：向细胞中加入细胞裂解液并旋转混匀，然后离心取上清，加入His-Flag-V5-GFP制备input样品（需另取部分作为SDS-PAGE的input样品使用）。

2.2. 抗体反应

（i）取Anti-V5-tag mAb-Magnetic Beads装入离心管中并用缓冲液洗涤（注意磁珠容易沉淀，使用前需进行充分旋转混匀）；

（ii）将适量制备好的input样品加入磁珠（Magnetic beads）中，并在4°C下旋转孵育适宜时间。

2.3. 洗涤：

（i）用缓冲液洗涤4次（盖子上粘附的东西也需清洗干净）；

（ii）加入SDS样品缓冲液，加热5分钟使目的蛋白从颗粒上分离，接着用磁力架磁性分离磁珠（由于可通过磁力固定，故在洗涤过程中几乎没有样品损耗）。

2.4. WB等后续操作

IP微珠选择：

1. 琼脂糖珠（样品体积> 2 mL）：当大量抗体成本较低且想要纯化大量目标蛋白用于多种下游分析时，琼脂糖最适用于柱亲和色谱或独立大型旋转杯免疫沉淀反应。

2. 磁珠（样品体积< 2 mL）：在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时，磁珠可实现结合能力/得率、可重复性、纯度和成本节约之间的平衡。当进行手动和自动化标准IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP和pull-down反应并立即用于后续检测分析时，磁珠是最佳选择。

参考：

[1] Bonifacino, J.S., Gershlick, D.C., and Dell'Angelica, E.C. 2016. Immunoprecipitation. Curr. Protoc. Cell Biol. 71: 7.2.1- 7.2.24. doi: 10.1002/cpcb.3

[2] ThermoFisher科技公司-免疫沉淀(IP)技术综述

[3] 知乎-蛋白纯化--免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）

[4] 知乎-一文看懂IP实验，完整实验流程看这里！

[5] Bjorck L. and Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein g, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 969-74

[6] Harlow, Ed, and Lane, David. (1999) Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press

[7] Wikstrom M. et al. (1995) Mapping of the immunoglobulin light chain-binding site of protein l. J Mol Biol. 250, 128-33