USP14是Ku70的去泛素酶，是自噬和PTEN缺陷细胞中非同源末端连接修复的关键因素

写在前面

        今天推荐的是由美国克利夫兰医学中心癌症生物学系在2019年12月19日发表于Nucleic Acids Research（2020IF：16.971，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Alexandru Almasan教授，研究表明AUSP14是Ku70的去泛素酶，是自噬和PTEN缺陷细胞中非同源末端连接修复的关键因素。

研究背景

        放疗 (RT) 是一种非常有效的治疗方式，可用于局部控制许多癌症组织学。虽然RT通过在细胞中诱导致命的DNA双链断裂 (DSB) 来根除肿瘤，但肿瘤细胞DSB修复途径有助于抵抗治疗。因此，揭示可以限制或抑制癌细胞DSB修复的新机制有望提高放疗控制肿瘤细胞生长和存活的有效性。

摘要部分

        作者将去泛素化酶USP14鉴定为一种新型自噬底物和IR诱导的DNA损伤反应 (DDR) 信号传导的调节剂。自噬的抑制增加了USP14的水平和DSB募集。USP14抑制RNF168 依赖性泛素信号传导和下游53BP1染色质募集。作者数据显示自噬缺陷细胞在NHEJ中存在缺陷。此外，在自噬缺陷细胞中，关键NHEJ蛋白的染色质募集减少。USP14过表达恢复了自噬缺陷细胞中NHEJ-DDR 蛋白的活性。质谱分析确定了USP14与核心NHEJ蛋白（包括 Ku70）的相互作用，这也通过免疫共沉淀进行了验证。一项体外测定显示USP14靶向Ku70进行去泛素化。AKT介导Ser432-USP14磷酸化，是USP14形成IRIF所必需的。与USP14阻断类似，AKT抑制恢复了自噬和 PTEN 缺陷细胞中NHEJ-DDR 蛋白的活性。这些发现揭示了USP14对NHEJ的新型PTEN/Akt依赖性负调节。

研究内容

1.自噬抑制导致USP14 IRIF形成增加     

        作者最近将USP14确定为自噬和DSB修复信号之间的关键环节。作者发现抑制自噬会上调USP14，反过来，它对RNF168进行负调节，RNF168是一种 E3 Ub连接酶，对于DNA DSB上的53BP1募集至关重要。由于53BP1募集对于NHEJ的下游激活至关重要，因此作者研究了USP14在调节NHEJ修复以响应自噬缺陷细胞中IR诱导的DNA损伤中的作用。     

        为了研究自噬的作用，作者使用氯喹 (CQ)或使用强力霉素 (dox)诱导ATG7敲低的方法。接下来，作者监测了细胞溶质 LC3-I转化为LC3-II的情况。作者发现dox诱导后，表达shATG7的LNCaP细胞中LC3-II水平降低，而且未用Dox处理的细胞LC3-II表达增高。这些数据证实shATG7诱导的LNCaP细胞缺乏针对IR的自噬响应。

        接下来，为了研究USP14在调节自噬缺陷细胞中DNADSB反应中的作用，作者研究USP14向DSB的募集。自噬的抑制导致dox+ LNCaP和CQ预处理的C4-2细胞中具有更高的染色质结合USP14。与USP14在调节RNF168和53BP1染色质募集中的作用一致，自噬抑制导致USP14水平增加进而导致IR诱导的染色质结合RNF168和53BP1减少，表明这些细胞中的NHEJ信号受损。另一方面，在IR处理后的所有时间点，表达shATG7的LNCaP细胞中USP14病灶的数量都增加了。在IR处理前用USP14抑制剂IU1预处理的shATG7表达细胞中USP14 IRIF形成显着减少，表明USP14的催化活性是其募集到DSB位点所必需的。

研究结论：自噬抑制导致SP14 IRIF形成增加。

2.USP14调节NHEJ相关的DDR信号     

        作者研究了在dox诱导型shATG7表达 LNCAP细胞中响应IR的DDR信号传导H2AX病灶的形成是DSBs的金标准标记，在IR诱导后短时间，是否dox诱导对H2AX病灶的形成无影响，然而在24小时后，仅在无dox诱导的shATG7 表达细胞中观察到显着减少的 H2AX病灶，表明自噬缺陷细胞中的DSB修复受损。此外，在自噬缺陷（dox+）细胞中，RNF168和 53BP1 IRIF的形成大大减少。另一方面，使用IU1对USP14的药理学抑制可以显着恢复DSB修复，并恢复dox+ 细胞中RNF168和53BP1的IRIF。总体而言，这些数据表明，诱导型shATG7表达细胞通过USP14调节 DDR信号传导。

        RIF-1是一种抗DNA切除因子，它被募集到磷酸化53BP1下游的DSB位点，其作用是抑制导致HR的DNA切除，从而促进NHEJ。因此，作者评估了RIF1是否与IU1处理的自噬缺陷细胞中的53BP1病灶形成相关。事实上，在自噬缺陷细胞中，RIF1 IRIF的数量减少。

研究结论：USP14负调节与NHEJ相关的DDR信号，以响应自噬缺陷细胞中的IR。

3.USP14阻止核心NHEJ蛋白的染色质募集     

        作者随后研究了USP14在通过染色质提取调节NHEJ核心复合物响应IR的募集中的作用。核心NHEJ复合蛋白，包括Ku70、Ku80、DNA-PKcs和XLF，被招募到自噬正常细胞中的染色质以响应IR处理。然而，在自噬缺陷细胞中响应 IR，NHEJ核心因子的染色质募集显着减少。有趣的是，在IU1处理的细胞中，Ku70、Ku80、DNA-PKcs和XLF的募集在自噬缺陷细胞中得到了有效恢复。DNA DSB上的NHEJ复合物组装对于有效的NHEJ修复至关重要。因此，接下来作者使用宿主细胞再激活报告基因测定探究USP14是否调节NHEJ DNA修复。作者发现与对照细胞相比，表达shUSP14的C4-2细胞的NHEJ水平显着增加。总的来说，这些数据表明USP14确实调节了自噬缺陷细胞中的NHEJ复合物组装。

        为了进一步评估USP14在NHEJ修复中的作用，作者探究了S2056和T2609上DNA-PKcs自磷酸化的状态，以及S1778上DNA-PKcs底物53BP1的状态。在自噬缺陷细胞中，DNA-PKcs S2056、T2609 和53BP1S1778 IRIF的数量在IR后大大减少。然而，在IU1处理的自噬缺陷细胞中，DNA-PKcs 自磷酸化和53BP1 S1778 磷酸化依赖性IRIF在表达shATG7的LNCaP细胞中显着恢复。

研究结论：USP14是DDR和NHEJ修复信号的重要调节剂。

4.AKT调节USP14作为DDR效应器的功能     

        由于USP14的蛋白酶体活性受S432上USP14的Akt依赖性磷酸化调节，作者研究了AKT是否影响USP14的功能。作者实验发现IR处理以时间依赖性方式诱导USP14病灶形成。此外，在IR处理后，表达 shATG7的LNCaP细胞中USP14病灶的数量显着增加。有趣的是，AKT的变构药物抑制剂MK2206显着降低了shATG7表达细胞中的USP14 IRIF。此外，在自噬缺陷细胞中IR后0.5和24小时，DNA-PKcs S2056、DNAPKcs T2609、53BP1 S1778 和RIF1病灶显着减少。另一方面，在MK2206处理的自噬缺陷细胞中，DNA-PKcs自磷酸化、53BP1 S1778磷酸化和RIF1病灶显着恢复。总体而言，数据表明，Akt调节USP14的核功能，使其成为一个DDR效应器。

        为了探索PTEN在NHEJ修复中AKT介导的USP14磷酸化中的作用，作者在IR后通过USP14在VCaP (PTEN+) 与LnCaP (PTEN-) 细胞中检测了IRIF。如预期所示，VCaP细胞未能形成核USP14 IRIF。

        此外，正如预期的那样，IR诱导的53BP1和DNA-PKcs S2056病灶的形成（PTEN-）LNCaP和C4-2自噬缺陷的细胞中减少，而在IU1处理的自噬缺陷的细胞中明显恢复。相反，在（PTEN+）LnCaP和C4-2细胞中，自噬缺陷和USP14缺陷对IR诱导的53BP1或DNAPKcs S2056灶的形成都没有任何明显的影响。

研究结论：在自噬缺陷的细胞中， Akt调节USP14 IRIF和NHEJ DDR信号。

5.USP14直接与Ku70相互作用并靶向其泛素化     

        为了进一步了解USP14的功能，作者通过质谱法鉴定USP14相互作用蛋白。FLAG-HA标记的USP14从C4-2细胞中瞬时表达和纯化，并进行质谱分析。除了与USP14共同纯化的许多已知蛋白，作者在USP14相互作用蛋白中鉴定了几种核心NHEJ蛋白。因为泛素化是 Ku70/80 从NHEJ后染色质解离的关键翻译后修饰，用于有效连接断裂的DNA末端，作者探究USP14与Ku70和Ku80的相互作用。     

        作者首先通过使用抗HA对来自共表达 Flag-HAUSP14和 EGFP-Flag-Ku70 的HEK 293T细胞的USP14进行IP来确认，结果发现USP14和 Ku70发生免疫共沉淀。作者进一步通过对来自LNCaP细胞的USP14进行IP，并对Ku70进行免疫印迹，证实了内源性Ku70和USP14之间的相互作用。     

        作者接下来探究Ku70是否是USP14去泛素化的直接目标。用IR处理转染了His-Ub和Flag-Ku70的HEK 293T细胞。用抗Flag珠纯化多泛素化的Ku70形式，并与重组人USP14孵化，进行体外去泛素化试验。在有USP14的情况下，Ku70的泛素化减少了。

        作者还检查了USP14是否使 Ku70 去泛素化并调节其蛋白质稳定性或其染色质结合以响应 IR诱导的DNA DSB。IR处理后不同时间点Ku70水平的比较显示shUSP14与shCtrl表达C4-2细胞没有变化。然而，在IU1抑制USP14后，IR 治疗后Ku70的染色质募集增加。

研究结论：USP14可以调节Ku70/80复合物的染色质募集，而不会显著影响这些成分蛋白水平的表达。

结论与讨论

        作者证明USP15调节HR和癌细胞对PARP抑制剂的反应。从机制上讲， USP15促进了BARD1/BRCA1在DBS的保留，从而促进了DSB末端的切除。因此， USP15对体内的DNA损伤修复至关重要。此外，USP15C端在乳腺癌患者中发生突变，破坏了USP15-BARD1的相互作用，导致HR缺陷。因此，USP15加作为影响HR和PARP1抑制剂反应的蛋白质之一，对控制和调节DNA末端切除具有一定的作用。

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原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkz1103