小奕说药 | 生产工艺过程中蛋白颗粒产生原因浅析

抗体或重组蛋白DS和DP生产过程中形成蛋白颗粒的现象已被广泛报道，如超滤洗滤导致蛋白溶液浊度升高、旋转柱塞泵灌装带来的亚可见微粒(SvP)，以及注射器内层硅油脱落导致的蛋白聚集和SvP等。

考虑到蛋白质颗粒可能引发的免疫原性风险，相关法规对注射液中10 μm及以上微粒的含量提出了严格要求（≥10 µm和≥25 µm的SvP限值分别为6000粒/支和600粒/支）。虽然法规尚未对＜10 μm的SvP含量提出监管要求，但是考虑到无法有效过滤的纳米微粒可能作为成核起始点进一步聚集，潜在影响产品在保质期内的安全性和有效性。因此生产过程中应尽量避免颗粒生成并严格控制颗粒数量。

蛋白质颗粒本质上是蛋白分子聚集而成，包含数千到数百万个单体分子。蛋白质聚集可概要为“成核”和“聚集体生长”两个阶段。首先是蛋白内部结构的变化导致形成二聚体或寡聚体的核心，随后聚集体生长，最终形成亚可见或可见的蛋白颗粒。

生产过程中蛋白分子会暴露于多重应力下，包括界面应力、机械剪切、空化、外来纳米颗粒、热应力等，这是导致蛋白质颗粒形成的主要原因。结合现有研究进展，简要介绍不同应力介导颗粒生成的原因。

一、界面应力

界面应力主要包括气液界面应力和液固界面应力，二者普遍存在于DS和DP工艺操作中。针对界面应力介导的颗粒生成原因，普遍认为蛋白质在这些相边界上吸附和富集导致蛋白质构象发生变化，形成聚集体、蛋白团簇或者蛋白膜，然后在机械作用（搅拌、泵送、拉伸等）下使聚集体、蛋白团簇或蛋白膜碎片进入主体溶液，进一步生长形成蛋白颗粒。所以，蛋白质聚集（成核）可能是在界面应力作用下开始的，但界面应力本身似乎不足以促进蛋白质颗粒的形成，需要在机械应力的协同作用下促进“核”进入蛋白溶液并不断在界面形成新的“核”，蛋白溶液中的“核”进一步聚集形成蛋白颗粒。

固体材料直接影响液固界面应力介导的蛋白颗粒形成，例如TFF过程中使用亲水性共聚物改性的管路能够减少蛋白质颗粒的形成并提高通量，不锈钢表面和氧化铝表面诱导的SvP显著不同。这些研究为DS和DP生产过程中耗材和设备的选择与提供了参考。

对于涉及界面应力的颗粒形成，在蛋白溶液中加入表面活性剂（PS80或PS20）可以有效抑制聚集和颗粒的形成。表面活性剂通过与蛋白分子在空气-溶液界面上竞争，或是在液固界面优先吸附从而起作用。

二、液压/机械剪切应力

搅拌过程中的机械剪切应力是蛋白质聚集的常见原因。剪切应力及其与界面应力的结合已被广泛研究多年。剪切应力介导的蛋白颗粒形成与产品对其敏感性高度相关，对于稳定性良好的蛋白来说，如果不涉及界面应力，仅高剪切应力似乎不足以使蛋白质聚集。例如一项对不同的蛋白质给予1.6x106 s-1的平均剪切速率(比生物加工中预期的剪切速率大3-5个数量级)研究中，测试的蛋白质均未显示聚集增加。单纯的高剪切力可能不足以使蛋白构象发生变化形成“核心”，但是高剪切力可以加剧气液或液固界面效应，以促进“核”的生成和其在蛋白溶液中的流通，进而加速聚集体生长。因此，蛋白颗粒的形成是机械应力和界面应力的叠加效果。由于实际生产中机械应力与界面应力通常共存，所以无法准确验证哪种应力对蛋白颗粒形成的贡献更大，但是二者都被认为是颗粒形成的必要条件。此外，实际生产中，通过调节机械参数降低机械剪切力以缓解蛋白聚集是最常用和最易实现的操作方法。

三、空化

流体动力空化是一种独特的流体动力现象，由于压力变化而在液体中形成气腔(常见于湍流中)。突然的压力下降会导致空腔(气泡)的形成，当暴露在高压下时，这些空腔(气泡)会迅速内爆。这种连续的空腔形成和塌陷会产生强烈的冲击并导致局部短暂的高温高压，可能导致蛋白质去折叠发生聚集，或形成自由基攻击蛋白质导致共价聚集发生。有报道称显示，仅仅从10英寸的高度将含有两种单抗液体制剂的小瓶掉在地板上就会引起机械冲击(空化)，从而引起蛋白质颗粒的生成。空化过程中可以产生羟基自由基，而羟基自由基可促进蛋白质的交联，并随之增加亚可见微粒。此外，空化会导致蛋白分子暴露在更多气液界面应力下。因此，空化作用导致的蛋白聚集和颗粒形成可以理解为机械应力，化学应力和气液界面应力的综合作用结果。

四、外来纳米颗粒成核

两个固体表面的研磨/磨损会使外来颗粒脱落到药物溶液中。一个广泛报道的例子是旋转柱塞泵，其中活塞和外壳的接触导致不锈钢纳米颗粒脱落，这些外来颗粒可能作为蛋白质颗粒形成的成核启动位点，省略了前期蛋白质聚集成核的过程，根据非均相成核理论，蛋白质进一步聚集并形成颗粒。另一种成核理论是由液固界面应力介导蛋白质分子吸附到固体表面，界面应力导致的蛋白质聚集体从固体表面解吸附，通过混合湍流回到蛋白质溶液中，作为“核心”促进微粒的进一步生长和形成。此时，固体表面积和湍流程度是实现这一机制的主要因素。因此，外来颗粒既可以作为“核心”又可以增加界面应力，二者协同作用促进蛋白颗粒形成。

五、热应力

两个固体之间摩擦/研磨产生的热量可能导致局部温度升高带来热应力。加热过程源于接触面上层的原子层之间的相互作用，摩擦加热导致的接触面升温足以导致接触面上蛋白质的构象变化。但是这种热能很难测量，因为它的持久影响是短暂的，而且极其局限。目前针对温度检测的方法（如红外探测）主要在宏观水平，而不是在受研磨影响的微观体积上，此外，液体溶液可以快速淬灭混合过程中产生的热量，导致无法探测瞬态热量。因此，测量和报告的温度无法代表蛋白质所经历的真实温度，实际摩擦点附近的蛋白质可能会经历极短时间(如<1 ms)的极端高温并导致降解，这种降解在大表面高频磨削下可能尤其明显。该理论在小型搅拌棒研究和大规模混合研究中都得到了支持，即增加接触表面积、速度或混合时间导致SvP增加。在一项针对某些类型的底置搅拌器混合操作时蛋白颗粒形成的研究发现，转子(叶轮)和定子(驱动单元)2个轴承之间的磨削是诱导颗粒形成的条件，并倾向归因于局部热效应。

小结

蛋白聚集和颗粒形成是一个复杂的过程，既与蛋白分子本身稳定性直接相关，又受工艺参数和操作的直接影响。生产中使用的不同耗材以及混匀搅拌等操作势必会将蛋白质分子暴露在不同应力下，而且不同应力通常共存在同一工艺过程中，比如蠕动泵送过程涉及界面、机械、纳米颗粒和热效应等多重应力。所以，现阶段蛋白颗粒的形成通常被认为是多重应力共同的作用结果。随着研究的不断深入，蛋白聚集和颗粒形成的机制将被阐释的更加清楚，也会给生产工艺的优化带来更多参考和启发。

参考文献

1. Wang W, et al., Protein aggregation - Mechanisms, detection, and control. Int J Pharm. 2018 Oct 25; 550(1-2): 251-268.

2. Deiringer N, et al., Proteins on the Rack: Mechanistic Studies on Protein Particle Formation During Peristaltic Pumping. J Pharm Sci. 2022 May; 111(5): 1370-1378.

3. Deiringer N, et al., Effect of the Tubing Material Used in Peristaltic Pumping in Tangential Flow Filtration Processes of Biopharmaceutics on Particle Formation and Flux. J Pharm Sci. 2023 Mar; 112(3): 665-672.

4. Gikanga B, et al., A Review on Mixing-Induced Protein Particle Formation: The Puzzle of Bottom-Mounted Mixers. J Pharm Sci. 2020 Aug; 109(8): 2363-2374.

5. Roffi K, et al., Adsorbed Protein Film on Pump Surfaces Leads to Particle Formation During Fill-finish Manufacturing. Biotechnol Bioeng. 2021 Aug; 118(8): 2947-2957.

6. Ghazvini S, et al., Evaluating the Role of the Air-Solution Interface on the Mechanism of Subvisible Particle Formation Caused by Mechanical Agitation for an IgG1 mAb. J Pharm Sci. 2016 May; 105(5): 1643-1656.

7. Duerkop M, et al., Impact of Cavitation, High Shear Stress and Air/Liquid Interfaces on Protein Aggregation. Biotechnol J. 2018 Jul; 13(7): e1800062.

8. Callahan DJ, et al., Control of Protein Particle Formation During Ultrafiltration/Diafiltration Through Interfacial Protection. J Pharm Sci. 2014 Mar; 103(3): 862-9.

9. Probst C. Characterization of Protein Aggregates, Silicone Oil Droplets, and Protein-Silicone Interactions Using Imaging Flow Cytometry. J Pharm Sci. 2020 Jan; 109(1): 364-374.

10. Kalonia CK, et al., Protein Adsorption and Layer Formation at the Stainless Steel-Solution Interface Mediates Shear-Induced Particle Formation for an IgG1 Monoclonal Antibody. Mol Pharm. 2018 Mar 5; 15(3): 1319-1331.

11. Gikanga B, et al., Processing Impact on Monoclonal Antibody Drug Products: Protein Subvisible Particulate Formation Induced by Grinding Stress. PDA J Pharm Sci Technol. 2017 May-Jun; 71(3): 172-188.

12. Gikanga B, et al., Mechanistic Investigation on Grinding-Induced Subvisible Particle Formation during Mixing and Filling of Monoclonal Antibody Formulations. PDA J Pharm Sci Technol. 2018 Mar-Apr; 72(2): 117-133.

13. Randolph TW, et al., Do Not Drop: Mechanical Shock in Vials Causes Cavitation, Protein Aggregation, and Particle Formation. J Pharm Sci. 2015 Feb; 104(2): 602-11.

14. Kennedy F. 2001. Frictional Heating and Contact Temperatures. In Bhushan B, editor Modern Tribology Handbook, ed., Florida: CRC Press LLC. p 235-272