第 2 章细胞工程

 植物细胞工程

1、植物细胞工程的理论基础（原理）：细胞的全能性，即，具有某种生命全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。这也是为什么植物的一瓣花瓣就可培育出完整的植株的原因。

理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整植株的潜力。但是，在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种组织和器官。这是因为，在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有选择性地表达出各种蛋白质，从而构成生物体的不同组织和器官。

全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞

2、植物细胞工程的基本技术：植物组织培养技术

3、植物组织培养技术

（1）概念：植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。

（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―――→愈伤组织 ―――→试管苗 ――→植物体

（3）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。

A、植物繁殖的新途径：

• 微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖

• 作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）

•  人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输

B、作物新品种培育

•  单倍体育种：

a过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。

b优点：明显缩短育种年限

•  突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）

• 细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。

（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

4、植物体细胞杂交技术

（1）概念：植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞，在一定条件下，融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。

（2）过程：如下图，其中，①去壁；②融合；③再生细胞壁；④脱分化；⑤再分化

（3）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

（4）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

动物细胞工程

动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。

1、动物细胞培养

（1）概念：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

（2）流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

（4）需要满足以下条件

①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。

③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。

④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。

（5）技术应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。

2、动物体细胞核移植技术和克隆动物

（1）概念：

• l动物体细胞核移植：是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体。

• l克隆动物：用核移植的方法得到的动物，称为克隆动物。

（2）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。

（3）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。细胞质不会抑制细胞核全能性的表达

（4）体细胞核移植的大致过程是（奶牛克隆为例）：

①高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；

②同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）；

③将供体细胞注入去核卵母细胞；

④通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；

⑤将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；

⑥生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛

（5）体细胞核移植技术的应用：

①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量；③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。

（6）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

3、动物细胞融合

（1）概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。

（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的对比：

4.单克隆抗体

（1）概念：简称单抗，单克隆抗体是指由淋巴B细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体／多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。

（2）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

（3）单克隆抗体的制备过程：(如下图)

①   对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应B细胞）；

②   提取B淋巴细胞；

③    同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；

④   促使它们细胞融合[注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选]；

⑤    在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞[特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体]；

⑥    然后对它进行克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞]；

⑦    最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。

（4）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

（5）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。

（6）单克隆抗体的应用：

l  作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，准确、高效、简易、快速。

l  用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。

 胚胎工程

1、胚胎工程

（1）概念：对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

（2）主要的技术手段：如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。

3.1 体内受精和早期胚胎发育

2、哺乳动物受精和胚胎发育的基本过程

（1）精子的发生：在睾丸内完成的。第一阶段：精原细胞进行有丝分裂，染色体复制，形成初级精母细胞；第二阶段：初级精母细胞进行减数分裂，产生含单倍染色体的精子细胞；第三阶段：圆形精子细胞变形成为精子（变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落）。[线粒体为精子运动提供能量]

（2）卵子的发生：在雌性动物的卵巢内完成。在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞（被卵泡细胞包围）；初级卵母细胞经减数分裂形成成熟的卵子（减一分裂在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体，并进入输卵管准备受精；减二分裂是在受精过程中完成的，次级卵母细胞分裂产生一个成熟卵子和第二极体。

★  当在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。

★  哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的。这是精子与卵子在发生上的重要区别。

（3）受精：是精子与卵子结合形成（即受精卵）的过程。包括受精前的准备阶段和受精阶段。

★  准备阶段1：精子获能（在雌性动物生殖道内）；

★  准备阶段2：卵子的准备(排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力)

★  受精阶段：精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。具体过程如下：[卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵黄膜]

n  a）顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。

n  b）透明带反应：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入，在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障]；

n  c）卵黄膜的封闭作用：精子外膜和卵黄膜融合，精子入卵后，卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障]；精子尾部脱落，原有核膜破裂形成雄原核，同时卵子完成减二分裂，形成雌原核

★  注意：受精标志是第二极体的形成；受精完成标志是雌雄原核融合成合子]。

★  自然条件下，受精是在母体的输卵管上段完成的。

（4）胚胎发育：a卵裂期：受精卵细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加，或略有减小。；

b桑椹胚：胚胎细胞数目达32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。

c囊胚：细胞开始分化（该时期细胞的全能性仍比较高），其中聚集在胚胎一端个体较大的细胞叫内细胞团，将来可发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部的空腔称为囊胚腔。（注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化）；

d原肠胚：有了三胚层的分化，内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。[细胞分化在胚胎期达到最大限度]

3.2 体外受精和胚胎的早期培养

3、体外受精：

哺乳动物的体外受精：主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。属于有性生殖过程。

（1）卵母细胞的采集和培养：对体型小的动物用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，从输卵管冲取卵子（可直接与获能的精子在体外受精）；对体型大的动物从卵巢中直接或间接（借助超声波探测仪、腹腔镜等）采集卵母细胞。（卵母细胞要在体外人工培养成熟后，才能与获能的精子受精）。

（2）精子的采集和获能：假阴道法、手握法和电刺激法；获能：对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法（放入人工配制的获能液中）；对牛、羊等精子用化学法（放在肝素或钙离子载体溶液中）；在体外受精前，要对精子进行获能处理。精子获能的方法有：培养法和化学诱导法两种。

（3）受精：获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下都可以在获能溶液或专用受精溶液中完成受精过程。

4、胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。

a）培养液成分：无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等[注意与动物细胞培养液成分的比较]；

b）胚胎发育到适宜阶段时，可将培养的胚胎取出，向受体移植或冷冻保存。

不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植；小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)

3.3 胚胎工程的应用

目前，胚胎工程应用较多的是家畜的胚胎移植、胚胎分隔、体外生产胚胎技术。

5、胚胎移植：

（1）概念：将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。

• 其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）

• 是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程，通过转基因、核移植、体外受精获得的胚胎必须移植给受体才能获得后代。是胚胎工程的最后一道“工序”。

（2）优势：可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期。

（3）胚胎移植的生理学基础：

★  同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的[对供体和受体进行同期发情处理]；

★  早期胚胎形成后处于游离状态，为胚胎的收集提供可能；

★  受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体的存活提供了可能；

★  供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

（4）胚胎移植的程序：

①   对供、受体母牛进行选择，选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。用激素进行同期发情处理；

②   对供体母牛用促性腺激素做超数排卵处理；

③   选同种优秀公牛配种或人工授精[有性生殖过程]；

④  对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。

⑤  对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。

⑥  直接向受体进行胚胎移植或放入－196℃的液氮中保存。

⑦   胚胎移植；

⑧   移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。

⑨   产下胚胎移植的犊牛。

6、胚胎分割：

（1）概念：用机械方法将早期胚胎切割成2、4、8等分等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。由于来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看作是动物无性繁殖或克隆的方法之一。

（2）基本过程：选择良好的桑椹胚或囊胚（期间的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可以用于胚胎分割）移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。（注意：对囊胚阶段的胚胎分割时，内细胞团要均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育）。

7、胚胎干细胞（ES或EK细胞）

（1）概念：由早期胚胎（囊胚）或原始性腺（胎儿）中分离出来的一类细胞，又叫ES或EK细胞。

（2）特征：具有胚胎细胞的特征，在形态上体积小、细胞核大、核仁明显；功能上具有发育的全能性，即可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。在体外培养下，ES细胞可以只增殖不分化；可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。

（3）应用：用于治疗人类疾病，如利用ES细胞诱导其分化成新的组织细胞特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复。

8、胚胎干细胞的主要用途有：

① 可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；

② 是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；

③ 可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；

④ 利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；

⑤ 随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。