G3BP1-Family-USP10去泛素化酶复合物可恢复因溶酶体降解而停滞的核糖体的泛素化40S亚

写在前面

        今天推荐的是由美国洛克菲勒大学在2020年5月19日发表于Molecular Cell（2020IF：17.970，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Thomas Tuschl教授，研究表明G3BP1-Family-USP10去泛素化酶复合物可恢复因溶酶体降解而停滞的核糖体的泛素化40S亚基。

研究背景

        准确读出遗传密码对于生产功能性蛋白质至关重要。因此，在转录和成熟后检测mRNA的错误，以及消除由突变等位基因编码的转录本，是至关重要的过程。核糖体相关质量控制 (RQC) 通过检测与异常mRNA碰撞的核糖体和不同小核糖体亚基蛋白的单泛素化，在E3连接酶ZNF598启动的多步分子过程中清除异常mRNA和新生多肽。

摘要部分

        作者表明RPS2、RPS3和RPS10的去泛素化需要G3BP1家族-USP10复合物，以从程序性降解中拯救修饰的40S亚基。USP10或G3BP1家族蛋白的敲除增加了溶酶体核糖体降解并扰乱了核糖体亚基化学计量，这两者都被RPS3的单个K214R取代所恢复。虽然大多数RPS2和RPS3单泛素化是由ZNF598依赖的核糖体碰撞感知启动RQC引起的，但另一个次要途径促成了它们的单泛素化。G3BP1家族蛋白长期以来一直被认为是RNA结合蛋白，然而，作者的结果将40S亚基和相关的mRNA确定为它们的主要目标，这是G3BP1家族蛋白在压力下定位的应激颗粒所共有的特征。

研究内容

1.G3BP1-Family-USP10复合物优先交联成熟mRNA和18S rRNA的编码序列     

        为了研究G3BP1-家族-USP10复合物的细胞功能，作者首先通过质谱分析和G3BP1-或USP10表达的HEK293细胞系的免疫印迹（IB）确认它们的稳定相互作用。作者发现，在表达 FH-G3BP1或 FH-G3BP2 的细胞系的光活化核糖核苷增强的交联和免疫沉淀 (PAR-CLIP)在预期的分子质量上产生了单个放射性标记的RNA蛋白交联带。然而，FH-USP10蛋白的 PAR-CLIP 产生了两个不同的放射性标记带，一个在 120 kDa 处对应于 FH-USP10，另一个在 70 kDa 处被 IB 鉴定为G3BP1，可能也包含 G3BP2。对应于 FH-USP10和共免疫沉淀G3BP1家族RBP的交联读数也彼此具有很好的相关性（Pearson r = 0.85）。

        最后，作者检测到USP10和G3BP1家族RBP与18S rRNA的交联，但未检测到28S rRNA。与H26的交联显示出不同但重叠的USP10和G3BP1蛋白的T到C转换模式，表明 rRNA表面和USP10-G3BP1家族的N端异二聚化结构域的空间接近性复合物结合，而不是直接与高亲和力rRNA结合。

研究结论：G3BP1-Family-USP10复合物优先交联成熟mRNA和18S rRNA的编码序列。

2.G3BP1-Family-USP10复合物调节多聚核糖体谱和核糖体亚基丰度

        亲本细胞裂解物的多聚核糖体分析和IB表明多聚核糖体中存在G3BP1、G3BP2 和USP10蛋白，但也存在较小的无核糖体大小部分。为了研究G3BP1-family-USP10复合物在翻译调节中的作用，作者首先生成了G3BP1或 G3BP2单个KO细胞。作者观察到KO和亲本细胞之间的细胞增殖没有显着差异。G3BP1和 G3BP2 双KO(G3BP1/2-DKO) 细胞是有活力的，但显示增殖率降低和普遍翻译停滞的迹象，伴随着多聚核糖体减少到单体和游离 60S 亚基的明显积累。在USP10-KO 细胞中，增殖率略有降低，作者还观察到60S亚基的明显积累。Dox诱导的FH-USP10表达则回补了USP10-KO细胞中的这种表型，而催化失活的FH-C424AUSP10则没有。

研究结论：G3BP1-Family-USP10复合物调节多聚核糖体和核糖体亚基丰度。

3.USP10介导40S核糖体亚基的位点特异性去泛素化

        USP10的酵母同源物Ubp3p是一种单泛素特异性蛋白酶，它利用Bre5形成活性酶复合物，从底物而不是多泛素链上切割单个泛素分子。为了鉴定G3BP1家族-USP10复合物的蛋白质靶标，作者在USP10-KO与FHUSP10过表达细胞中进行了泛素残留免疫亲和分析。作者在USP10-KO细胞中最富集的泛素化蛋白中鉴定了RPS2、RPS3和RPS10（log2FC > 5），并通过IB确认了这些结果，没有观察到RPL23A （RPL23A是酵母Rpl25的人类同源物，是Ubp3p在酵母营养饥饿条件下的一个常用的靶标）的泛素化。RPS2、RPS3和RPS10的单泛素化被 FH-USP10的表达回补。G3BP1/2-DKO也导致单泛素化RP的积累，尽管与USP10-KO 相比程度较低。亲本或G3BP1/2-DKO细胞裂解物中USP10的IB显示G3BP1/2-DKO后USP10蛋白水平显着降低，表明USP10异源二聚化具有G3BP1蛋白的稳定功能。与亲本细胞相比，在USP10-KO 细胞的40S、80S和多聚体部分中可检测到单泛素化RP的富集。

研究结论：USP10介导40S核糖体亚基的位点特异性去泛素化。

4.G3BP1-Family-USP10复合物对40SRP的去泛素化可防止40S亚基溶酶体降解     

        为了揭示位点特异性RP（去）泛素化的功能，作者对亲本、USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 细胞裂解物进行了基于质谱的无标记蛋白定量。与亲本细胞相比，作者观察到USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 细胞中40S和 60S RPs 相对于所有其他蛋白质的特异性减少。与亲本细胞相比，USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 细胞中 18S rRNA与 28S rRNA的UV260吸光度比证实了蛋白质组学差异。为了确定哪种蛋白质和位置特异性单泛素化负责40S亚基的降解，作者首先通过过度表达C端Myc标记的野生型、K214R、K227R、K230R 或 K227R/K230R 突变RPS3来取代内源性RPS3。IB证实了Myc标记的野生型和突变型RPS3对内源性RPS3的化学计量替代。重要的是，通过表达K214R-RPS3来阻断RPS3的泛素化，回补了USP10-KO 以及G3BP1/2-DKO 细胞中核糖体亚基的失衡。另一方面，K214R-RPS3的单独表达消除了内源性RPS2的泛素化。

        为了进一步研究核糖体亚基降解的机制，作者用 pH 敏感的荧光Keima蛋白标记RPS3、K214R-RPS3和 RPL28，以量化酸性溶酶体的重定位。在亲本或USP10-KO 细胞中表达的Keima嵌合体用Torin1处理导致561/445 nm荧光强度比增加，也称为自噬通量。有趣的是，在没有 Torin1、RPS3-Keima 而不是突变体K214R-RPS3-Keima 的情况下，与亲本细胞相比，USP10-KO中的自噬通量增加，表明K214处的RPS3泛素化对溶酶体降解至关重要。此外，与RPS3-Keima 相比，RPL28-Keima的自噬通量总体上变化不太明显，这与RPS3泛素化后40S亚基降解的驱动作用一致。

研究结论：G3BP1-Family-USP10复合物对40SRP的去泛素化可防止40S亚基溶酶体降解。

5.USP10或G3BP1系列RBP不会损害功能RQC

        ZNF598是异常mRNA碰撞核糖体的传感器，通过位点特异性泛素化RPS10和RPS20 触发RQC，而一些研究还指出RPS3的ZNF598依赖性泛素化。为了评估G3BP1家族-USP10复合物在感知异常mRNA中的潜在作用，作者生成了稳定表达GFP和 mCherry (mCh) 融合蛋白的报告细胞系。正如预期的那样，与亲本细胞相比，KO细胞系在由对照 (ACTAGC)6间隔区连接的荧光融合蛋白的表达中没有受到干扰。然而，与亲本、USP10-KO 和G3BP1/2-DKO 细胞中的 (ACTAGC)6 间隔区相比，由 (AAA)12 间隔区连接的融合蛋白的表达降低了10倍，表明RQC处于活跃状态并且USP10或G3BP1家族RBP在其启动阶段。相比之下，无论间隔序列如何，ZNF598-KO 细胞中的荧光融合蛋白表达都没有改变，因为这些细胞无法感知异常mRNA。RPS10的K138R突变部分重现了这种效果，防止核糖体碰撞时依赖ZNF598的RPS10单泛素化。相反，过量表达C端Myc标记的野生型、K214R、K227R、K230R或K227R/K230RPS3的亲本细胞中的报告蛋白表达没有改变，表明无论RPS3单泛素化如何，对碰撞和活性RQC的感应没有受到干扰。

研究结论：USP10或G3BP1系列RBP不会损害功能RQC。

6.ZNF598介导的核糖体碰撞感知是培养细胞中RPS2、RPS3和RPS10单泛素化的主要原因    

        为了确定依赖ZNF598的40SRP单泛素化的程度，用低剂量或高剂量的翻译延伸抑制剂茴香霉素处理亲本、USP10-KO 和USP10-ZNF598-DKO 细胞，以诱导核糖体停滞和不同程度的核糖体碰撞。低剂量茴香霉素处理已显示以ZNF598依赖性方式刺激核糖体碰撞和RPS10泛素化，而高剂量茴香霉素处理诱导所有核糖体急性停滞，几乎没有核糖体碰撞和RPS10泛素化。在亲本细胞中，作者证实低剂量茴香霉素处理比高剂量处理诱导更强的RPS10单泛素化。茴香霉素诱导的RPS2和RPS3单泛素化与剂量无关，表明RPS2和RPS3单泛素化也与核糖体碰撞无关。     

        在USP10-KO细胞中KO ZNF598可以防止RPS10的单泛化，然而，一些残留的RPS2和RPS3的单泛素化仍然存在，其对茴香霉素处理不敏感。同样，在USP10-KO 细胞中Myc标记的K138R-RPS10的表达也降低了RPS2和RPS3单泛素化水平。残留的单泛素化表明存在未知的E3连接酶，优先靶向在ZNF598介导的RPS10单泛素化后进入RQC的碰撞核糖体。

研究结论：ZNF598介导的核糖体碰撞感知是细胞中RPS2、RPS3和RPS10单泛素化的主要原因。

7.40SRP 的去泛素化发生在依赖RQC的核糖体解离的下游

        RQC是协调停滞的核糖体解离和异常mRNA和新生多肽降解的有序过程。核糖体亚基解离需要 PELO、HBS1L 和 ABCE1 蛋白。与亲本细胞相比，PELO-KO 细胞显示出80S 核糖体的强烈积累，这些核糖体也富含单泛素化RPS3。尽管USP10-KO 和USP10-PELO-DKO 显示出更高水平的RPS3泛素化，但在除PELOKO、G3BP1/2-DKO 或USP10-KO 之外的细胞系中未观察到单泛素化RP的积累，这表明组装的核糖体不受G3BP1家族-USP10复合物去泛素化的影响，包括进入RQC的停滞核糖体。

        另一方面，在不存在ZNF598和 PELO 的情况下，G3BP1的RNA交联强度显着降低，这表明进入RQC并随后进行核糖体分解，这对于暴露mRNA和 18S rRNA进行交联是必要的。用K214R-RPS3取代RPS3，防止ZNF598诱导的RPS2和RPS3单泛素化不会损害G3BP1交联效率，更下游的RQC因子NEMF或LTN1的KO也没有影响。

研究结论：G3BP1-家族-USP10-复合物在碰撞的核糖体分解后优先被招募到mRNA结合的40S亚基上。进入RQC的40S亚基的去泛素化阻止了它们在溶酶体中的周转，并使它们恢复到将来用于翻译的状态。

结论与讨论

在这里，作者探究了G3BP1家族-USP10复合物在RQC产生的40S亚基中RPS2、RPS3和RPS10位点特异性去泛素化的功能，以及一个替代核糖体单泛素化的过程。G3BP1家族RBP或USP10的KO导致40S亚基的溶酶体降解，从而导致核糖体亚基化学计量学紊乱。RPS3的单个K214R替换阻止了其单泛素化,恢复了40S亚基的周转。总之，恢复翻译停滞的核糖体的过程通过G3BP1家族-USP10复合物对40SRP进行去泛素化,以防止40S亚基程序性溶酶体降解。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.12.024