奥维森科技：荣登传染病学和微生物学领域一区期刊：肠道微生物+大肠杆菌蛋白组学研究
大肠杆菌是导致全球范围内大量腹泻病例的一种重要的病原体，生物还原剂替拉帕扎明（TPZ）在临床上用于治疗各种类型的癌症，也对大肠杆菌菌株具有明显的抗菌活性。TPZ通过调节耐药性相关基因的表达，诱导了大肠杆菌耐药性的逆转，这可能在耐药性细菌感染的临床治疗中具有辅助作用。近日，北京农学院动物科学技术学院在传染病学和微生物学领域期刊《International Journal of Antimicrobial Agents》（IF= 10.8，JCR Q1）上发表了题为《New insights into the antimicrobial action and protective therapeutic effect of tirapazamine towards Escherichia coli-infected mice》的研究成果，旨在评估TPZ对大肠杆菌感染小鼠的保护性治疗作用，并深入了解其抗菌作用机制。
奥维森科技在研究中提供了肠道微生物组学和大肠杆菌蛋白质组学测序及分析服务，下面就让小编带大家一起来看看这篇文章吧！
替拉帕扎明对大肠杆菌感染小鼠的抗菌作用和保护性治疗作用的新见解
合作单位
北京农学院
研究背景
大肠杆菌是人类和动物常见的肠道微生物，也是第五常见的主要食源性病原体，可导致严重的肠道疾病。抗生素的过度使用和滥用加速了抗生素耐药性细菌的传播，多重耐药（MDR）菌的增加已成为全球公共卫生的主要威胁，且耐药（AMR）菌株可以在环境、动物和人中广泛传播，从而对感染疾病控制构成挑战。替拉帕扎明（TPZ）是一种杂环二氮氧化物，是一种生物还原剂，可通过诱导DNA和染色体断裂导致细胞凋亡，同时也具有杀菌作用，且在厌氧条件下更具活性。此外，也有研究报导过TPZ对MDR菌株的抗菌活性。
本研究旨在通过体外抗菌活性、耐药性逆转、生物膜形成和蛋白质组学分析来深入了解TPZ的抗菌作用机制，并通过观察临床症状、组织细菌负荷、组织病理学特征和肠道微生物群变化来评估TPZ对大肠杆菌感染小鼠的保护性治疗作用，了解TPZ作为一种潜在的单一或联合抗菌剂治疗病原体感染的有效性和安全性。
样本采集与处理
将50 mL大肠杆菌悬浮液用TPZ的一半最小抑菌浓度（MIC）激发6小时作为处理组（ET），使用另外50 mL的大肠杆菌悬浮液作为未处理的对照组（EC）。采集ET和EC细胞并在-80 °C下储存，在timsTOF Pro质谱仪上进行4D Label-Free检测用于蛋白质组分析。
5周龄雌性BALB/c小鼠，被适应性喂养一周，并被随机分为三组：对照组（C）、大肠杆菌感染组（E）和大肠杆菌感染+TPZ治疗组（ET）。大肠杆菌激发试验通过腹膜内注射5.0×106CFU/小鼠的剂量进行，感染当天被视为第0天。感染后3天，治疗组小鼠通过腹膜内注射25 mg/kg剂量的TPZ，每天两次，持续7天，大肠杆菌感染组注射不含TPZ的溶剂。在感染后11天从每组收集新鲜的小鼠粪便用于扩增子测序以分析粪便微生物群。
测序区域和平台
微生物组 16S rRNA V3-V4区；Illumina Miseq PE300。
蛋白质组 4D Label-Free；timsTOF Pro质谱仪
研究成果
1、TPZ对大肠杆菌的体外抗菌活性和细胞活力
测定了TPZ对大肠杆菌E和E-10菌株的MIC均为25 μM，在50 μM和更高浓度的TPZ下，两种大肠杆菌菌株的生长都被完全抑制。TPZ对两株大肠杆菌的最小杀菌浓度（MBC）均为50μM，表明TPZ对大肠杆菌具有较强的抗菌活性。
HD11细胞的TPZ的半数毒性浓度（CC50）值为37.97 μM，Vero细胞的TPZ的CC50值为593.5 μM，表明TPZ在较高浓度下对细胞具有潜在的毒性。TPZ对Vero细胞的CC50值是MBC值的10倍，说明制定合理的药物剂量和程序可以有效防止复合物对细胞活力的损害。
2、TPZ逆转大肠杆菌耐药性表型
两种大肠杆菌菌株都是MDR菌，经TPZ处理后各类耐药性已从中度敏感降至敏感，TPZ影响大肠杆菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多肽类、酰胺醇类和四环素类抗生素的耐药性。TPZ对大肠杆菌具有强效的抗生物膜能力，并可能解释耐药性表型的逆转。
3、TPZ诱导的差异表达蛋白的蛋白质组学分析
使用4D Label-Free蛋白质组学技术研究了TPZ对大肠杆菌中蛋白质表达的影响，在EC和ET组中鉴定出2218种蛋白质，分别有53和47种蛋白质上调或下调。
4、蛋白质GO和代谢通路分析
TPZ处理后，大肠杆菌色氨酸代谢、过氧化氢酶、牛磺酸与下丘脑代谢相关蛋白显著上调。色氨酸在肠道免疫耐受和维持肠道微生物组平衡方面发挥着重要作用。此外，DNA损伤、修复和重组相关蛋白RecA、Holliday连接ATP依赖性DNA解旋酶RuvB、tRNA假尿苷合成B、DNA回旋酶B亚基和原体蛋白I也显著上调。保护细菌免受活性氧自由基（ROS）引起的氧化应激的蛋白质显著下调，导致细胞代谢中氧化还原稳态破坏，主要涉及免疫系统中的过氧化氢酶、抗氧化剂、双功能过氧化氢酶和硫氧化还原蛋白/谷胱甘肽过氧化物酶BtuE。
5、TPZ在大肠杆菌感染的小鼠模型中显示出潜在的疗效
与未治疗组相比，TPZ治疗显著减轻了大肠杆菌感染诱导的体重减轻、死亡率、结肠炎，还提高了小鼠的存活率。TPZ治疗后7天，小鼠体内细菌载量急剧减少，几乎所有的细菌都被从体内清除。组织学分析显示，TPZ治疗小鼠腺体结构破坏和炎症细胞浸润显著减弱。结果表明，在小鼠感染模型中TPZ有效地改善了感染症状、结肠炎和细菌定植。
6、TPZ治疗诱导小鼠肠道微生物群变化
与C组比较，E组和ET组的肠道微生物群多样性呈下降趋势。主成分分析显示，ET组的微生物群落组成与E组和C组截然不同，表明TPZ处理在一定程度上影响了小鼠的微生物群落构成。γ-变形菌、放线菌和弯曲杆菌是粪便微生物群中的主要门。
LEfSe分析显示E组中Helicobacter、Helicobacterbilis和Lachnospiraceae含量丰富，ET组中Turicimonasmuris，bacterium_Ellin5012和Lactobacillus acidophilus丰度增加。KEGG分析显示，C、E和ET组的差异表达蛋白在ET中显著富集。大肠杆菌感染和TPZ治疗强烈影响了小鼠的肠道微生物组结构，特别是关于Bacterium_Ellin5012，Bacterium，Bifidobacteriumsp，Staphylococcusequorum，uncultured Corynebacterium和Lachnospiraceae。
研究结论
1、TPZ在体外和体内均能有效抑制大肠杆菌的增殖。
2、TPZ的耐药性逆转活性是通过调节与大肠杆菌耐药性和生物膜形成相关的基因来实现的。
3、蛋白质组学分析表明，TPZ对大肠杆菌的抗菌活性可能是通过破坏细菌DNA来实现的。
4、TPZ提高了大肠杆菌感染小鼠的存活率，TPZ对小鼠的保护性治疗作用也可能与肠道微生物群的调节有关。
参考文献
Zhouhui W, Yu W, Lei L, etl. New insights into the antimicrobial action and protective therapeutic effect of tirapazamine towards Escherichia coli-infected mice[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2023.
