目的蛋白不可溶，形成包涵体？
蛋白表达纯化问题概述：
Q: 为什么目的蛋白总是以包涵体形式出现?
A: 在原核表达纯化中目的蛋白经常发生错误折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导后目的蛋白表达通常可达细胞总蛋白的50%以上，虽然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多达95%的蛋白则存在于包涵体。如何获得更多可溶蛋白。
原理解析：
优化培养条件当重组蛋白高效表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白的折叠速率，此时，蛋白就会以包涵体的形式在细胞内形成。所以，降低蛋白的合成速率可一定程度上的改善重组蛋白的可溶性。
上清表达解决方案如下（按照可操作性的顺序如下）：
1、诱导前，使用较低的细菌值，可以进行测定，OD600（通常为0.6-0.8）；
2、改变诱导条件，低温，可以测试不同的温度梯度（如16°C，25°C，30°C，37°C等）、降低IPTG浓度（0.01-0.1mM）并延长诱导时间、长时间能够保证细菌有足够的时间进行折叠。或者向培养基中加入0.4mol/L蔗糖，高渗引起了渗透性休克反应，该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，为蛋白的正确折叠提供了环境； 自诱导培养基，适合于T7启动子系列的诱导表达，当工程菌增长到一定密度后，自己缓慢开启诱导开关，缓慢诱导蛋白表达，利于蛋白正确折叠，便于可溶性表达。
3、更换载体；启动子选择 载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要，pET系列的 T7/T7 lac为强启动子，强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成，如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体，如pGEX系列，还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。
4、使用促溶标签
采用融合标签表达融合标签用于检测和纯化目的蛋白，有时也通过增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白转运到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表达载体或蛋白序列中常添加一些可溶性标签，如GST，NusA，MBP，Sumo等，这些标签在宿主中表达的蛋白质会有高度的可溶性，在与外源蛋白质融合后，从而促进外源蛋白的可溶性表达。
这个需要解决的问题在于后续需要用蛋白工具酶切割融合蛋白，再纯化除去工具酶和促溶蛋白，最终回收目的蛋白，纯化操作可能会比较繁琐。
如果有兴趣，可以往下看，有更加详细的描述。
目的蛋白不可溶，形成包涵体？
首先确认目的蛋白是否有表达。裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，是否形成了包涵体。包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达载体与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。目前认为包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件，如降低诱导时菌液的OD值等，以减缓蛋白的积累。
采用融合标签表达融合标签用于检测和纯化目的蛋白，有时也通过增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白转运到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表达载体或蛋白序列中常添加一些可溶性标签，如GST，NusA，MBP，Sumo等，这些标签在宿主中表达的蛋白质会有高度的可溶性，在与外源蛋白质融合后，从而促进外源蛋白的可溶性表达。
选择合适的质粒载体降低蛋白的合成速率除了改变诱导条件，还可以通过更换弱启动子来调节。pET系列载体有T7/T7lac强启动子，提高了重组蛋白的表达量，但是也增加了形成包涵体的概率。为了提高蛋白的可溶性表达，我们可以选择让弱启动子或带有融合标签的载体，如pCold、pBAD、pGEX等，这些载体在重组蛋白表达上可一定比例的提高蛋白的可溶性。
优化培养条件当重组蛋白高效表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白的折叠速率，此时，蛋白就会以包涵体的形式在细胞内形成。所以，降低蛋白的合成速率可一定程度上的改善重组蛋白的可溶性；降低蛋白的合成速率有很多途径，对于固有的质粒载体来说，通常采用降低诱导温度和诱导剂浓度的方法。为了提高蛋白可溶性的同时保证蛋白的表达量，我们可以对不同温度梯度和诱导剂不同浓度梯度进行实验设计，从而得到最佳诱导表达条件。
Q: 为什么目的蛋白总是以包涵体形式出现?
A: 在原核表达纯化中目的蛋白经常发生错误折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导后目的蛋白表达通常可达细胞总蛋白的50%以上，虽然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多达95%的蛋白则存在于包涵体。为了获得更多可溶蛋白，在实验过程中，可以降低诱导温度，例如16-30℃，或降低IPTG浓度（0.01-0.1mM）并延长诱导时间，还可以采用特别的培养基培养细菌。
表达为包涵体蛋白可能原因一是目的蛋白含有二硫键，二硫键形成困难，可以利用促进二硫键形成的各种载体标签，建议表达菌株是Origami 2， Rosetta-gami 2， Rosetta-gami B；二是表达过快，表达量过高，可以降低诱导温度，IPTG浓度优化，建议表达菌株是Tuner, Rosetta-gami B。
Q: 能不能说一下原核蛋白纯化方式及选择方法
A: 蛋白纯化方法常用的有亲和纯化、离子交换、切胶回收。
1. 一般带有HIS，GST，SUMO，Fc等融合标签的蛋白，我们可以通过Ni柱、GST柱、protein A等进行亲和纯化，用亲和纯化方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，方便快捷。
2. 如果不想让重组蛋白带有标签，可以先表达带标签重组蛋白，亲和纯化后用蛋白工具酶切割融合蛋白，再纯化除去工具酶。或者直接表达无标签重组蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化。
3.如果需要表达的蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫后获得的抗体进行WB实验，灵敏度较高。
Q: 获得的蛋白是有活性的吗？
A: 要让原核表达重组蛋白有活性，条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白折叠状态甚至检测活性的方法的差别都可能导致蛋白活性差异。一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化得到的蛋白活性要好，所以我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白折叠达到最接近活性状态。
载体上表达的蛋白“有问题”有时候，当表达的蛋白是非溶性的，或折叠错误，不当切割或对细菌宿主有毒性时，目的蛋白往往不能正常诱导表达。在这种情况下，您需要优化诱导条件（详见下文），或者替换成更耐受的宿主菌株或更换表达载体类型。诱导条件有待优化根据待表达基因，表达载体和宿主菌株等因素，您可能需要考虑优化以下诱导条件：OD600（通常为0.6-0.8）；诱导剂（如IPTG或L-阿拉伯糖）的浓度不能太低或太高；诱导持续时间不能太短或太长；诱导温度，特别是在处理“有问题”蛋白时（见上文），可以测试不同的温度梯度（如16°C，25°C，30°C，37°C等）。在极少数情况下，由于原因不明，相同表达载体的不同克隆可能会表现出不同的表达能力，因此您可能需要挑选多个单菌落进行单独测试，以筛选出具有最佳诱导效果的克隆。
