钩藤-衰老克星？
来源 TMR Publishing Group
作者 Traditional Medicine Research 编辑部
钩藤被广泛用于治疗肝风内动，惊痫抽搐，高热惊厥。
钩藤的主要化学成分有生物碱、三萜酸类、黄酮类、酚类和香豆素，其中生物碱是其重要的活性成分，且丰度较高，具有显著的抗炎、降压和抗神经退行性作用。
中国科学院上海药物研究所果德安教授团队最新研究 Pseudotargeted metabolomics for exploring the changes of neurotransmitters profile in aging rat brain and the potential neuroprotective effect of alkaloids from Uncaria rhynchophylla. Tradit Med Res. 2022;7(5):41. doi:10.53388/TMR20220303002 通过传统药理学结合拟靶向代谢组学手段对钩藤生物碱的神经保护作用进行了研究。
研究方法
使用20种不同的提取溶剂，采用液-液萃取（LLE）、蛋白沉淀（PPT）和固相萃取（SPE）等方法对大鼠脑组织中神经递质的提取方法进行优化。利用UHPLC-MS/MS技术建立一种检测脑组织中神经递质的拟靶向代谢组学方法，结合药理学实验评估钩藤生物碱的神经保护作用。
研究结果
提取方法的优化
对比了LLE、PPT和SPE三种提取方法发现大多数神经递质可在SPE的清洗步骤中检测到，因此SPE不适用于神经递质的提取。在LLE方法中，非极性萃取剂提取出的神经递质成分较少，而极性萃取剂(正丁醇和异丙醇)可以提取大部分神经递质成分。甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-乙腈混合溶剂作为蛋白质沉淀剂提取神经递质的能力很强，如图1所示。通过比较各种神经递质对应的相对峰面积发现甲醇-乙腈(4:1,v/v)的PPT法表现出优越的提取能力。
方法验证
方法学验证结果显示线性、精密度和稳定性均满足拟靶向代谢组学的要求(表1)。在脑组织匀浆液中每种分析物均具有较好的线性(图2)，且所有分析物的r2值均大于0.8,其中有71%的待测物超过0.95。此外，日内精度RSD为2.55% ~ 9.03%，日间精度RSD为2.02% ~ 12.55%，因此可认为日内和日间精确度符合实验要求。稳定性RSD为3.68%~9.24%，表明神经递质在24h内无明显变化，待测物稳定性符合实验要求。
生物样本分析
该研究测定了1月和8月鼠龄的大鼠脑组织样本中神经递质的代谢谱。采用无监督模式识别和有监督模式识别(OPLS-DA)法进行统计分析，确定了7种差异性成分，即γ-氨基丁酸、亮氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸和色氨酸，这些差异性成分随着大鼠年龄增长而增加。大鼠大脑中神经递质水平的变化情况如图3所示。
脑组织中钩藤生物碱分析
生物碱是钩藤的主要活性成分，大鼠灌胃钩藤水煎剂后，利用钩藤生物碱对照品的质谱数据，在脑组织中鉴定出了7种生物碱，分别为钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱和缝籽嗪甲醚。因此，可认为钩藤生物碱可以穿过大鼠的血脑屏障。
生物碱对谷氨酸（Glu）诱导的SH-SY5Y细胞活性的影响
通过细胞活力测定法评价生物碱对Glu诱导的SH-SY5Y细胞的神经保护作用，如图4所示，与对照组（相对细胞活性为100%）相比，Glu处理组的细胞活性显著降低（42.37%±1.48%），而去氢毛钩藤碱（84.63%±2.25%）、毛钩藤碱（83.16%±3.26%）和缝籽嗪甲醚（92.06%±3.60%）则显著提高了Glu诱导SH-SY5Y细胞的活性。
生物碱对Glu诱导的SH-SY5Y细胞中ROS、SOD、MDA和GSH水平的影响
如图5A所示，Glu导致SH-SY5Y细胞中ROS水平升高，而去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱和缝籽嗪甲醚降低了Glu诱导的SH-SY5Y细胞中ROS水平。MDA、GSH和SOD的水平测定结果如图5B-D所示，与阴性对照相比，Glu诱导后细胞内GSH和SOD水平显著降低、MDA含量显著升高，而去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱和缝籽嗪甲醚干预Glu诱导的细胞后，细胞的MDA水平显著降低、GSH和SOD的水平显著升高，说明去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱和缝籽嗪甲醚具有明显的神经保护作用。
生物碱对Glu诱导的SH-SY5Y细胞蛋白表达的影响
如图6所示，与阴性对照相比，Glu显著提高了cleaved-caspase-3的表达水平，而去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱和缝籽嗪甲醚降低了Glu诱导的SH-SY5细胞中cleaved-caspase-3的表达，说明生物碱对Glu诱导的兴奋性神经毒性具有保护作用。此外，这些生物碱还降低了Glu处理的SH-SY5细胞中p-ERK和p-p38的蛋白表达。结果表明，去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱和缝籽嗪甲醚可通过ROS-MAPK/ERK信号通路有效地降低Glu诱导的细胞毒性和氧化损伤，可作为治疗神经性疾病的候选药物。
结论
本研究对神经递质的提取方法进行了系统的研究，认为甲醇-乙腈(4:1,v/v) PPT法对脑组织中神经递质具有较好的提取能力。建立了同时检测26种神经递质的分析方法，在大鼠脑组织中共检测到21种神经递质，其中7种氨基酸神经递质(天冬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸和γ-氨基丁酸)在1至8个月大鼠之间发生了显著变化。对灌胃钩藤水煎液后的大鼠脑组织进行分析，共检测出了7种生物碱，确定了钩藤中的生物碱能穿过血脑屏障。通过检测Glu诱导的SH-SY5细胞中与氧化应激相关的因子的表达水平发现钩藤生物碱可通过抑制氧化应激和凋亡途径降低Glu诱导的SH-SY5Y细胞的兴奋性神经毒性，为钩藤用于治疗衰老相关疾病提供可靠依据。
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引用格式
Li SW, Wu YS, Wu SF, et al. Pseudotargeted metabolomics for exploring the changes of neurotransmitters profile in aging rat brain and the potential neuroprotective effect of alkaloids from Uncaria rhynchophylla. Tradit Med Res. 2022;7(5):41. doi:10.53388/TMR20220303002
传统医学研究 Traditional Medicine Research（ISSN 2413-3973）创刊于2016年，专注于发表具有明确历史记载、民族特色和地域特色的传统医药学研究和相关社会科学研究。目前已被Emerging Sources Citation Index (ESCI), 中科院期刊分区, Embase, ProQuest 等数据库收录。
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