生物制药综合实验一青霉素的发酵和提取模块

(一)生产、纯化原理:青霉素生产最初使用特异青霉(eieilim notatum),后改用产量更高的产黄青霉(P chrnsogemum)。乳糖可收缓慢利用而维持青霉素生产的有利条件，玉米浆含多种氨基酸和苯乙胺，可为青毒素合成提供前体。青霉素为弱酸性pKa=2.75,在pH=2时呈游离酸状态。易溶于醇、酮、醚、陷类，水溶性较差。pH=7左右，青霉素可与碱金属或碱土金属成盐，水溶性显著提高。青霉素金属盐易溶于水和甲醇、几乎不溶于乙随、氯仿、醋酸戊酯等。

(二)滴定原理:青霉素在碱性环境下时，B-内酰胺环水解生成青霉噻唑酸，1 分子青霉噻唑酸和4分子碘起反应。而青霉素不吸收碘，硫代硫酸钠(或其他盐)可以消耗刺余的碘，滴定则可以计算耗碘量。空白实验可以用于排除体系中可能存在的其他耗碘物质。

(三)试剂:

1. 1 mol/L盐酸，1 mol/L NaOH.

2.0.5%淀粉指示剂。

3. 0.01 molL (实际浓度需要标定) Na2S2O3.

4. 0.01molLb2:取13g碘单质溶于36%KI定容至100 mL.加3滴盐酸。使用时稀释100倍即为0.01mol/L碘

5. pH4.5酣酸缓冲液: 25.8g醋酸钾， 加入19.6mL醋酸，定容至2000 mL.

6. 2%碳酸钠溶液

7. 20%乙酸钾-乙醇溶液:乙酸钾加入到无水乙醇中

8.无水硫酸钠

9.乙酸丁酯

10. pH试纸

11.青霉发酵液

(四)实验步骤:

产黄青霉发酵:

1.配置马铃薯培养基，取马铃薯去皮切块，称取200 g煮沸20min后，加水定容至1000 mL.称取20g乳糖/燕糖加入培养基:

2.分装培养基并灭菌，121 摄氏度 20 min:

3.称取卡那霉素，配置成50 mg/mL的母液，  0.22 um滤膜过滤除菌，分装:

5.接种产黄青霉南孢子，28心180 rpm培养7d.

青霉素提取纯化及检测:

1.产黄青霉发酵培养7d;

2.使用纱布过滤菌丝球，收集滤液，测定上清液总体积:

3.使用盐酸调节pH值至2左右(尽快)，估测滤液体积，

4.加入约1/3体积的乙酸丁酯，震荡10 min后静置5min分层，有机相(上层)备用:

5.下层水相继续加入初始总体积1/3的乙酸丁酯，重复上一步，弃去水相:

6.混合两次溶剂，读取体积，加入其1/3体积的2%碳酸钠溶液，農荡10 min后静置5 min分层，水相(下层)备用:

7.重复上一步，弃有机相:，

8. 混合两次水溶液，重复第4-5步，收集并混合有机相(此时体积约为发酵体积的827);

9.在乙酸丁酯中加入少量无水硫酸钠，过滤:

10.将液体加入到烧杯中，加入约120体积乙酸钾-乙醇溶液，1s C搅拌10 min (或置于冰箱内，每隔几分钟搅拌一次)。 小心倒掉上清液，湿品体真空干燥:

11.称取适当样品加水溶解(参考浓度约1 mg/mL,最少8 mL):

12. 滴定:取2mL样品，加0.4 mL Imol/L NaOH,室温静置20 min;

依次加入0.4 mL 1 mo/L盐酸、2 mL pH4.5乙酸缓冲液、8 mL 0.01 mol/L碘溶液，混匀后暗处静置20 min:

加1 mL淀粉指示剂，0.01 mol/LNa2S2O3;滴定(溶液由蓝色变为终点为无色)，记录消耗体积v13.空白滴定:取2mL样品，不加酸碱，依次加入2mL pH4.5乙酸缓冲液、8 mL0.01 mo/L碘溶液，混匀后暗处静置20min:.

加1 mL淀粉指示剂，0.01 molLNa2S2O3;滴定(溶液由蓝色变为终点为无色)，记录消耗体积V

4.依照公式计算青霉素浓度和纯度

(五)实验结果:

(六)实验讨论

青霉素产物的纯度和什么有关?