腺病毒怎么测滴度？

腺病毒滴度检测采用TCID50法：

滴度单位：PFU/mL，是空斑形成单位，为Plaque Forming Unit per mL的缩写。

I. 细胞准备

①培养293A 细胞，待细胞生长密度约为80-90 % 时，消化细胞并计数细胞量；

②用含有5% FBS的 DMEM 培养液制备细胞悬液，按每孔100 μL（1×10 4个细胞）加入2个96孔板；

II. 加病毒

②       将96孔板中的11、12两列各加入100 μL 5% FBS的 DMEM，做阴性对照；

②96孔板中的A-H排，依次各加100 μL 标记为8个连续梯度稀释的病毒样品溶液，盖上第一个板并在37°C CO 2培养箱中培养；

③同样步骤操作第二块板；

实验中培养板的结构如下图：

III. 观察结果并计算滴度

①将96孔板置于37°C CO2培养箱中培养10天，从第3天到第10天观察细胞状况。

②第10天分析、记录CPE结果：

CPE应在10天之内出现。第10天在显微镜下观察每孔CPE情况，并与阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数。

注意：如有一个板被污染，实验必须重做

③病毒活性计算公式：

对于100 μL样品，滴度T＝101+d（s-0.5）

d＝log10稀释度＝1（对于10倍的稀释度而言）

s＝阳性比率之和（从第一个10倍稀释度算起）

将TCID50/mL转换成PFU/mL：

T＝a×10bTCID50/mL＝a×10b-0.7PFU/mL

两次重复实验得到的滴度值应相差≤100.7

以Ad-GFP滴度测定为例： 测定结果为1.99×1011PFU/mL

滴度： T=101+(10.5-0.5)=1011.0TCID50/100uL

将TCID50/mL换算成PFU/mL

T=1011.0-0.7/100uL=1010.3/100uL=1.99×1010PFU/100uL =1.99×1011PFU/mL

注意事项：

①稀释病毒液时要充分混匀。 每次吸病毒液时要更换Tip头，以防导致稀释不准确。

②本检测须做两组重复实验，两组实验可在同一天进行，也可在不同天进行。

Q&A:

Q1: protocol中所说的CPE和TCID50具体是指什么？

A1:CPE（cytopathic effect）指的是病毒感染细胞后导致细胞出现病变效应，TCID50（tissue culture infective dose 50%）指的是半数组织培养感染剂量，即50%的细胞发生CPE时的病毒稀释度。

Q2:滴度单位VP、PFU、IU分别是什么?

 A2:不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。

VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性） 和 “死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。

PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的 “活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。

IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。

Q3： TCID50测定腺病毒滴度可以用293T细胞吗？

A3：不可以，腺病毒确实E1A基因，该基因与病毒复制相关，293A细胞是反向表达E1A基因的细胞系，腺病毒感染后可以复制扩增，293T不能反向表达该基因，腺病毒感染后不能复制扩增。