只要你对CRISPR/Cas9技术稍微有些了解，就一定知道在CRISPR/Cas9实验中，gRNA的设计将很大程度上影响项目的成功率。Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并产生双链DNA断裂（DSB）。由于DSB的不完全修复而产生插入和缺失（indels），引起移码突变，导致终止密码子提前，实现编码基因敲除的目的。但往往很多人在设计gRNA这一步就屡屡碰壁，我们本周也收到了一些关于gRNA的设计与选择的问题，今天就和大家一起讨论：

Q1：通常在构建CRISPR/Cas9系统敲除某种基因的时候选用的是单gRNA还是双gRNA，它们两者有什么区别吗？

A：理论上讲单gRNA只能靶向基因的1个位点，敲除的转录本数量有限，脱靶率较高，而双gRNA能在很大程度上解决这两个问题，也能实现较大的基因片段敲除，因此双gRNA载体的敲除效果会比单gRNA载体好，但实际操作中，要具体情况具体分析，提前制定合适的实验方案，才能在最少的预算中得到想要的实验结果，我们目前会使用红棉CRISPR基因编辑系统（点击使用）进行基因敲除方案的智能设计，因为它整合了5000多例基因编辑成功案例的实验数据以及几个主流的基因数据库，只需要输入基因名称就可以免费得到3套优质方案，能减少我们的实验试错成本。

Q2：请问gRNA有哪些设计规则，可以推荐一个好用的gRNA设计工具吗？

A：首先设计gRNA时需要考虑很多因素，这里就提三个必须要遵守的规则：
gRNA的序列特异性要足够强；
gRNA序列要尽量覆盖较多的转录本；
避免编码氨基酸的靶向区域过于接近蛋白质的N端或C端；
但事实上我们通常是借助gRNA设计工具来进行gRNA的设计，一个好用的gRNA设计工具可以让我们事半功倍，减少试错成本，推荐你可以将张峰实验室的sgRNA设计网站和我们红棉系统的gRNA设计工具搭配使用，不过有一点还需要提醒的是，并不是gRNA的分数越高，它的敲除效果就越好，你可以通过红棉系统全面了解所编辑的基因再做出符合实际的选择。

Q3： 如何提高gRNA的打靶效率？

A：如何提高gRNA的打靶效率是每个研究CRISPR/Cas9技术的科研人员都十分关注的问题，不论是从gRNA的序列优化，还是改变gRNA载体的传递方式，又或者是增加gRNA的数量等等，都可以在一定程度上提高gRNA的打靶效率，总之提高打靶效率的方法有很多种，要结合具体情况进行优化，如果需要帮助，欢迎使用我们免费的红棉CRISPR基因编辑系统或者咨询我们！