Chelex-100 从干血斑中提取 DNA

Chelex-100提取DNA准则

来自干燥血斑的疟原虫DNA是通过在5%Chelex 100的悬浮液中加热样品来提取的。在碱性悬浮液中加热到近100ºC会破坏细胞膜并分解蛋白质，包括热不稳定的酶，而Chelex 100（一种离子螯合剂）通过灭活核酸酶和螯合可能破坏寄生虫DNA的重金属来限制DNA的破坏。这种方法使得获得适合PCR的寄生虫DNA成为可能。它是一种快速，廉价，有效的DNA提取方法。由于这是PCR过程的第一步，因此保持无菌技术以防止提取的DNA污染非常重要。

Chelex-100提取DNA所需材料和设备

1.5毫升微量离心管

1-20 μl 单通道自动移液器

100-200μl单通道自动移液器

1000 μl 单通道自动移液器

上述移液器的过滤器移液器吸头

细笔尖记号笔

圆珠笔

纸巾或湿巾

蒸馏水

磷酸盐缓冲液 (PBS)

烧杯或洗瓶中的漂白剂 (5%)

烧杯或洗瓶中的蒸馏水

烧杯或洗瓶中的乙醇 (70 %)

Chelex-100 树脂

剪刀或 1/8 英寸打孔器（如果使用打孔器，请加上备用滤纸）

定时器

微量离心机

加热块或 56 ºC 水浴

沸点水浴（96 ºC 或以上）

涡流

Chelex-100提取DNA程序步骤

要记住的要点：

• 确保在开始手术前彻底清洁剪刀，在

• 在切割滤纸之间和程序结束时。 不干净的剪刀

• 可能导致样品交叉污染和质量差的结果。

•  确保移液器吸头质量高、无菌且不含核酸内切酶。

• 请勿触摸移液器吸头。

• 确保定期校准和清洁移液器。

1. 打印一份 PCR 工作表并记录每个待测 DBS 的样本 ID单独的编号行。

2. 收集所有必需的用品。注意。 如果样品已在 +4 ºC 或 -20ºC 下储存，则必须将它们带到房间样品袋开封前的温度。

3. 收集所有必需的用品。通过加入蒸馏水（例如 0.2 g Chelex 和 10毫升蒸馏水）。注意： Chelex 试剂应根据需要每天新鲜制作。

4. 将剪刀或打孔器浸入乙醇 (70%) 中并通过火焰。

5. 标记适当数量的 1.5 ml 微量离心管（盖上两个盖子和试管的一侧）带有工作表编号和样品 ID。

6. 切割 2-3 块 3 mm x 3 mm 或打孔 3 mm 圆盘（可容纳约 3-5 μl干血）从滤纸中取出，放入相应的 1.5微量离心管或 96 孔微量滴定板的孔。

注意： 按照步骤 5 中的详细说明清洁每个样品之间的剪刀。用干净的滤纸冲孔 3 次。

7. 加入 1 毫升 PBS。注意： 确保滤纸浸泡在缓冲液中。

8. 室温孵育 10 分钟。

9. 14,000 rpm 离心 2 分钟，用干净的每个样品的移液器吸头。

10. 加入 1 毫升 PBS

11. 14,000 rpm 离心 2 分钟，用干净的每个样品的移液器吸头。

12. 加入 150 微升无核酸酶水。

13. 加入 50 微升 20 % Chelex。

14. 99 ºC 孵育 10 分钟。

15. 14,000 rpm 离心 1 分钟。

16. 将上清液储存在 +4ºC 以用于 PCR。注意：如果样品储存时间超过一天，请将上清液转移到新鲜的微量离心管并储存在 -20 ºC。