「青莲客户文章」MAP4K4通过减少ADAM10依赖性N-钙粘蛋白裂解促进卵巢癌转移
卵巢癌是女性癌症死亡的常见原因，占癌症死亡的5%。由于其早期无症状，大多数卵巢癌在晚期才被诊断出来，且出现腹腔转移现象，癌症转移是癌症致死的主要原因。转移性卵巢癌与机体复发和耐药密切相关，对卵巢癌转移的透彻了解被认为有助于提高癌症治愈率，但仍未得到很好的阐明。
卵巢癌转移研究的一个重要方面是驱动分子的鉴定。近日，青莲百奥合作客户浙江大学医学院附属妇科医院妇科肿瘤科吕卫国团队在《Oncogene》上发表了一篇题为“MAP4K4 promotes ovarian cancer metastasis through diminishing ADAM10-dependent N-cadherin cleavage.”的研究文章。在这项研究中，作者确定MAP4K4是卵巢癌转移的关键驱动因素。
标题：MAP4K4 promotes ovarian cancer metastasis through diminishing ADAM10-dependent N-cadherin cleavage.
期刊：Oncogene（IF =8.756）
时间：2023.03
背景
MAP4K4是一种与Ste20激酶家族相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，可促进卵巢癌细胞SKOV3的迁移。据报道，MAP4K4在局灶性粘连动力学、胰腺肿瘤发生、宫颈癌的化学敏感性、肝细胞癌的上皮-间充质转化和转移以及肺腺癌的肿瘤维持中均有核心作用。然而，破译MAP4K4在卵巢癌中的迁移作用的详细机制和更直接的证据仍然缺乏。
研究思路
通过比较卵巢癌原发性和转移组织的基因表达谱进行了无偏倚的高通量筛选，发现与卵巢癌转移相关的最重要的激酶MAP4K4，并进行底物磷酸化蛋白的验证（青莲百奥提供服务）。确定MAP4K4是卵巢癌转移的关键驱动因素。通过体内异种移植小鼠模型腹腔注射MAP4K4抑制剂观察卵巢癌的转移抑制情况确定MAP4K4在卵巢癌转移中的癌症促进作用及其作为治疗靶点的潜力。
研究内容
1、MAP4K4的高表达与卵巢癌患者的腹膜转移和预后不良有关
作者通过对卵巢癌原发肿瘤和腹膜转移肿瘤进行了转录组测序。与原发组织相比，MAP4K4在转移组织中的表达水平更高。由于转移导致不良预后，作者接下来旨在研究MAP4K4与卵巢癌患者预后之间的相关性。Kaplan-Meier分析显示，原发肿瘤中MAP4K4水平高的患者预后明显较差。此外，来自TCGA、GSE19829、GSE26193、GSE27651、GSE26712和GSE3061的数据显示，MAP4K4的高表达与预后不良有关，与作者的队列数据一致。作者还注意到，MAP4K4的表达与CA125的血清表达和腹水体积呈正相关。转录组测序数据证明了与原发肿瘤相比，转移性肿瘤具有不同的基因表达谱。作者推断MAP4K4是腹膜转移过程中表达最多的激酶，是卵巢癌转移形成的重要驱动因素。
2、MAP4K4依赖其激酶活性促进卵巢癌症细胞迁移、侵袭和粘附
为了研究MAP4K4在卵巢癌体外进展中的生物学功能，作者采用了几种细胞系。通过qRT-PCR和免疫印迹法检查MAP4K4在卵巢癌细胞系中的表达。结果显示，MAP4K4在SKOV3中表达较高，在A2780细胞中表达较低。首先用三种siRNAs来下调MAP4K4在SKOV3细胞中的表达，由于siRNA1和siRNA2对MAP4K4的敲除程度较高，因此选择它们进行进一步研究。CCK8和EdU检测数据的结果显示，MAP4K4敲除并不影响细胞增殖，用菌落形成试验证实了这一结果。
为了评估MAP4K4对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响，作者进行了伤口愈合和转孔实验，当MAP4K4被敲除时，观察到伤口愈合明显延迟。用GNE-495（一种MAP4K4的特异性抑制剂）处理细胞时，伤口愈合也明显延迟。为了模拟MAP4K4对卵巢癌细胞粘附行为的影响，进行了粘附测定，结果显示MAP2K4敲低能够降低癌细胞的粘附性能。为了进一步研究MAP4K4的效果，通过使用CRISPR / Cas9基因编辑产生了具有MAP4K4敲除（KO）的SKOV9细胞系。与母体细胞相比，MAP4K4-KO细胞的迁移能力明显下降。过量表达MAP4K4 WT或激酶活性突变体，能够改善A2780细胞的迁移缺陷。这些结果共同表明，MAP4K4的促迁移作用依赖于其激酶活性。
3、MAP4K4激活上皮-间质转化稳定N-钙粘蛋白
为筛选确切的转移相关生物学过程，进行了GSEA分析，该分析源于转移性肿瘤与原发性肿瘤表达水平的比较分析。其中，上皮-间充质转化（EMT）特征在转移组织中富集最显著。TGF-β（转化生长因子-β）通过诱导上皮-间充质转化作为肿瘤促进因子。为了验证EMT过程的上调，使用TGF-β处理诱导SKOV3细胞从上皮表型到间充质样表型，细胞状态明显发生转变。后续作者发现EMT表型可能由MAP3K4的过表达诱导，就进一步研究了MAP4K4对其表达的影响，结果显示N-钙粘蛋白在MAP4K4敲低或敲除后显着降低，证明更多的应激纤维形成和细胞表面更多的细胞伪足，类似于TGF-β处理的效果。
4、MAP4K4通过ADAM10依赖性方式稳定N-钙粘蛋白
先前研究报道金属蛋白酶，包括基质金属蛋白酶（MMPs）和ADAMs可介导N-钙粘蛋白的脱落。为了研究N-钙粘蛋白在SKOV3细胞中的表达水平是否受金属蛋白酶的调节，作者检测了SKOV3细胞中各种MMPs和ADAMs的表达水平。其中MMP1、MMP7、ADAM10、ADAM15、ADAM17和ADAM19高表达。进一步研究这些蛋白质对N-钙粘蛋白稳定性的影响，发现敲低ADAM10，显著阻断了MAP4K4敲低时N-钙粘蛋白的减少。ADAM10是一种跨膜金属蛋白酶，可释放一系列细胞表面蛋白，包括Notch、Eph和N-钙粘蛋白。同时免疫沉淀结果表明，在MAP4K4敲除后，ADAM10与N-钙粘蛋白的结合增强。上述结果表明，MAP4K4可能通过ADAM10依赖机制稳定N-钙粘蛋白。
5、MAP4K4和ADAM10互作
通过生成一系列MAP4K4和ADAM10的结构域缺失突变体来进行定位分析MAP4K4和ADAM10之间的相互作用。结果表明，MAP4K4通过其CNH结构域与ADAM10相互作用，因为ADAM10-HA与MAP4K4 CNH结构区缺失突变体的结合显著降低。由于MAP4K4属于Ste20激酶家族，推断ADAM10可能是MAP4K4磷酸化的底物。为了验证这一观点，使用磷酸标记凝胶来解析磷酸-ADAM10蛋白；用ADAM10抗体进行免疫沉淀测定，用抗泛磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体检测ADAM10的磷酸化水平。观察到一致的结果。当MAP4K4被抑制时，ADAM10磷酸化降低。结果表明ADAM10与MAP4K4相互作用并被磷酸化。
6、ADAM10的活性被MAP4K4介导的S436磷酸化抑制
为了验证MAP4K4介导ADAM10发生磷酸化，Flag标记的MAP4K4野生型（WT）、激酶结构域缺失突变体、激酶活性突变体、激酶非活性突变体和HA标记的ADAM10被过表达，研究它们对ADAM10磷酸化的影响。当野生型MAP4K4过表达时，ADAM10的磷酸化增加，并且通过活性形式的MAP4K4的过表达显著增强。相反，没有激酶结构域或MAP4K4的非活性形式的MAP4K4过表达对ADAM10磷酸化显示出边际效应。表明MAP4K4的激酶活性是ADAM10磷酸化所必需的。在所有突变体中，作者观察到S436A突变体中ADAM10磷酸化的显著减少。用磷酸标记凝胶检测ADAM10磷酸化观察到一致的结果。S436属于金属蛋白酶结构域。因此，推测S436磷酸化是否在ADAM10活性的控制中。通过检测N-钙粘蛋白的稳定性来研究S436磷酸化对ADAM10活性的影响。为此，构建了催化失活的ADAM10 E384A突变体作为阴性对照，并构建了ADAM10 S436E突变体以模拟S436的磷酸化。在S436E突变体和E384A突变体中观察到N-钙粘蛋白降解的显著减弱，这表明ADAM10的S436磷酸化可能控制其活性。为了确定MAP4K4是否直接磷酸化ADAM10，进行体外激酶测定，其中将纯化的ADAM10 WT、ADAM10 S436A突变体与MAP4K4孵育。结果表明，ADAM10 WT可以磷酸化，而ADAM10 S436A不能磷酸化。为了测试ADAM10 S436A是否影响其与MAP4K4结合的能力以及随后磷酸化的降低，进行了免疫沉淀。通过WB检测ADAM10与标记有Flag的MAP4K4。未观察到ADAM10带的显著减少。此外，质谱分析证实S436是ADAM10的磷酸化位点。这些数据表明MAP4K4在S436磷酸化ADAM10，从而抑制ADAM10的活性。
7、MAP4K4促进裸鼠异种移植模型中卵巢癌转移
为了验证MAP4K4在体内卵巢癌症转移中的生物学功能，建立了体内异种移植裸鼠模型。首先，使用MAP4K4抑制剂GNE-495来抑制MAP4K4的活性：在将SKOV3细胞注射到裸鼠腹腔两周后，每天通过腹膜内注射注射GNE-495，28天后，处死小鼠，收获肿瘤组织，测定转移数量。结果显示：未经GNE-495处理的小鼠的卵巢细胞腹膜内播散比接受GNE-496治疗的老鼠明显得多，尤其是在肠系膜、脾脏和肝脏。HE染色显示肿瘤细胞侵入肝组织。此外，对肿瘤淋巴结数量的定量分析表明，对照组形成了更多的转移。N-钙粘蛋白的免疫荧光分析和免疫组织化学染色表明，当用GNE-495处理时，N-钙粘素减少。为了排除GNE-495的非特异性作用，将MAP4K4-KO SKOV3细胞和对照细胞腹膜内注射到裸鼠中。与对照组相比，MAP4K4敲除显著减少了腹膜转移的数量。这些结果表明MAP4K4促进了卵巢癌症转移的形成。
总结
转录组分析已将MAP4K4确定为卵巢癌转移的新型启动子。MAP4K4能够增强细胞粘附，迁移和侵袭，稳定N-钙粘蛋白并促进体内转移。MAP4K4通过在Ser436磷酸化ADAM10来控制N-钙粘蛋白的稳定，导致ADAM10活性降低。综上所述，MAP4K4是一种新颖而重要的抗转移治疗靶点。
