调控蛋白通过分子间的相互作用来发挥生物学功能，进而影响到生物表型，这是生物功能研究最简单的逻辑结构。发生功能的生物大分子，其相互作用可不像不谙世事的钢铁直男，只有“是”与“否”两个简单的选择。处于调控通路的关键蛋白，往往万转千回，各种效应因子参与其中，与高级结构修饰（泛素化、磷酸化、乙酰化等）紧密联系在一起，让调控过程扑朔迷离。

通过大量参考文献可以看出，绝大部分的调控蛋白都有不同程度的泛素化和去泛素化现象，因此，解析蛋白的泛素化过程，更能还原分子功能的真实机制。

泛素底物蛋白与对应的E3连接酶种类繁多，目前的AI仅能预测人、小鼠以及少量的模式植物，对于植物科研的研究者来说，只能孤身勇往直前。钟鼎生物在为科研用户进行基因功能验证时，与诸多科学家一道，总结出一套简便可行，成功率高的实验策略。

第一步：发现潜在的E3连接酶

A计划：针对关键的调控基因，可以通过酵母双杂交筛选技术或者pull down-LC-MS技术发现其特异性的E3连接酶。

B计划：通过UbiBrowser针对底物靶蛋白预测其最可能的E3连接酶。

第二步：验证底物蛋白与E3连接酶的互作关系

按照钟鼎生物数十例的项目经验来看，最终泛素化成功的案例中，底物蛋白与E3连接酶在体外无一例外都有相互作用，因此进行蛋白泛素化之前，建议先确证底物蛋白与E3连接酶的互作关系。

A计划：表达E3蛋白及底物蛋白，使用GST pull down方法验证底物蛋白与E3连接酶互作，如果重组表达蛋白呈现包涵体状态，可以尝试使用无细胞表达体系，获得可行性蛋白。

B计划：使用酵母双杂交点对点验证底物蛋白与E3连接酶互作

第三步：蛋白泛素化及泛素化水平检测

蛋白泛素化是在E1\E2\E3\Substrate\Ub\ATP酶促体系内完成，钟鼎生物目前有两种方案可以实现蛋白泛素化，分别是细胞裂解液法（体内法）和商业试剂盒法（体外法）。

A体内法：钟鼎生物构建了E1/E2/Ub三蛋白共表达的酵母菌株，只需要E3连接酶蛋白和底物蛋白添加到泛素酵母细胞裂解液中，即可实现半体内的泛素化反应，也有一些科学家将底物及E3连接酶在研究的宿主材料中过表达，可以完全实现体内泛素化，这个方案钟鼎生物暂未建立，无法提供该类型技术服务。

B体外法：使用商业化的泛素试剂盒，按照操作流程进行泛素化操作,反应结束后，可以使用泛素抗体检测底物的泛素化水平， 亦可以使用底物蛋白的特异性抗体或携带的标签抗体进行检测， 如果需要使用两种抗体同步检测，加收相应的检测费用。

参考文献:
Proteasomal degradation of MaMYB60 mediated by the E3 ligase MaBAH1 causes high temperature-induced repression of chlorophyll catabolism and green ripening in banana

说明：MYB60是调控下游叶绿素基因的关键转录因子，推测RING类E3泛素连接酶MaBAH1介导MaMYB60泛素化降解，从而减弱MaMYB60对下游叶绿素降解代谢途径的激活效应，通过GST pull down实验能证明两者的相互作用，通过泛素化实验可以进一步验证这一推论。

参考文献：
The Arabidopsis U‐box E3 ubiquitin ligase PUB30 negatively regulates salt tolerance by facilitating BRI1 kinase inhibitor 1 (BKI1) degradation