蛋白表达原核系统最常见的12个问题解析（下）
我要的是全长蛋白，怎么还有截短的产物，这是怎么回事？
1. 一个最直接原因就是蛋白水解了。 2. 然而第二点翻译起始也非常有可能。起始密码子AUG (Met) 的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点序列 (AAGGAGG)的间隔序列(通常是5–13个核苷酸)时，容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成 麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体，例如pET-28和pET-30系列载体在N-端和C-端都有 His-Tag。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。pET-29和pET-30系列 载体在N-端融合有HiS-Tag序列而C-有His-Tag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His- Bind树脂亲和纯化以获取全长蛋白。
His标签包在蛋白质结构内部还能用蛋白酶切除吗？
一般重组蛋白纯化标签被包在内部，可以增加所提的蛋白质样品的溶解度，比如适量增加变性试剂浓度或类型使得蛋白质的肽链松散开暴露出（组氨酸）6标签。另外，还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型，加大DTT浓度（DTT浓度<1mmol/L，否则DTT会与Ni
2+
结合），适当调整调高盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L，从低浓度到高浓度逐渐分梯度上升），总之，作用就是增加蛋白质的可溶性，因为his6的亲水性较强，增加可溶性之后his6容易暴露在水相。加大DTT浓度也可以切断二硫键使得蛋白质的肽链松散，进而使his6容易暴露在水相，从而方便纯化和酶切。再者重新构建，不加His-tag。
目的蛋白大于100kd或含有多个亚基，是否可以用原核表达系统？
在细菌中已经非常成功底表达了很多大蛋白。多亚基复合物则可以通过分别表达各亚基，然后在有尿素的溶液中，将各组分以适当比例混和，再透析除去变性剂。
是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？
位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被用来切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起 使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。
如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？
蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。
E. coli
会去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸吗？这种加工对目的蛋白的稳定性有何影响？
N-端fMet是否被去除受倒数第二个氨基酸影响。这个加工过程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下关系支配：去除的困难程度随倒数第二位氨基酸的支链大小的增加而降低。研究者在实验中发现以下氨基酸种类出现在倒数第二的位置上时，此加工过程极少发生或根本没有发生：His、Gln、 Glu、Phe、Met、Lys、Tyr、Trp和Arg。而当倒数第二位上是其它种类的氨基酸时，加工过程发生的可能从16%到97%，确定了在大肠杆菌中蛋白氨基末端氨基酸与其稳定性之间的关系，也即“N-端原则”。具他们报导：如果下列氨基酸位于氨基端时蛋白的半衰期仅为2分钟：Arg、 Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr。相反，其它氨基酸位于氨基端时可以使受检蛋白的半衰期长达10小时以上。综上两条研究可以得出结论：Leu在氨基末端时很容易因为fMet被去除而暴露出来，从而导致蛋白的迅速水解。显然，当采用pET载体上的 Nco I 或 Nde I位点表达非融合蛋白时，完全不必担心Leu的密码子出现在倒数第二的位置上。 德泰生物原核蛋白表达服务（http://www.detaibio.com/protein-bacterial.html）采用大肠杆菌表达系统进行重组蛋白生产，拥有超十年的蛋白表达经验，已成功交付3000+组蛋白。客户只需提供目标蛋白对应的基因或蛋白序列，同时提供相关要求即可。我们会按照合同约定的表达量、纯度进行交付。
