基因与药物共传递的应用有助于解决RNA药物作用时间短的问题

RNAi是控制靶标基因表达的有力工具，但是，作为RNAi触发器的小干扰RNA (small interfering RNAs)或者短发夹（RNA short hairpin RNAs），往往容易诱发机体不利的副作用，从而影响其治疗效果。2022年4月，Becker等人以评论的形式在Molecular Therapy Nucleic Acids杂志上发表文章。Alsing及其同事通过将依赖于Argonaute 2的shRNA（agshRNAs）嵌入到micro RNA主链中，从而实现RNA polymerase II启动子的组织特异性表达。此外，通过RNA-seq对agshRNAs和传统shRNA产生的副作用进行深入的比较。这项研究证实了提高RNAi安全性和效率，以及检测方法监测序列特异性或非特异性副作用的潜力。此外，该研究还强调，同时确保靶标基因敲除效率与治疗效果不是特别容易实现的。

通过外源引入或人工表达RNAi 触发器，利用内源性RNAi途径进行靶向 mRNA沉默已有20多年的研究历史。其中，最常用的RNAi触发器是shRNA，尤其是通过慢病毒或腺相关病毒载体递送时，可以实现持续性的目标敲除。它们的表达通常由诸如U6之类的RNA pol III启动子驱动，它可以在转导的细胞中产生大量的RNAi效应子，并产生强有力的基因敲低。然而，根据shRNA序列、丰度和其他参数，shRNA可能诱导不良副作用，包括（1）脱靶效应；（2）细胞RNAi机制的饱和以及与内源性miRNA的竞争；（3）诱导免疫反应，在最坏的情况下能够导致体内毒性。

以往对于哺乳动物细胞内miRNAs的处理过程的认识和了解，极大的促进了我们对RNAi触发器的认识。通常情况下，在primary miRNAs表达之后，这些分子经历了两步成熟过程。首先，Drosha/DGCR8复合物在发夹茎的5’和3’端修剪primary miRNAs，产生一个precursor miRNA的中间物；接下来，Exportin-5 将precursor miRNA（或 shRNA）转位到细胞质中，在由 RNase III Dicer 进一步加工。产生的 RNA 双链体与 RNA 诱导的沉默复合物 RISC 中的四种 Argonaute 蛋白 (Ago1-4) 之一结合，其中引导RNA链保持与目标mRNA的结合，随从链则被降解。在shRNAs的情况下，一个令人担忧的问题是，随从链偶尔会被保留下来，然后诱发对非目标mRNAs的不必要的抑制。

如前所述，这一点可以通过利用基于miRNA miR451的改良的仅有导引的效应器而得到缓解。这种miRNA使用一种非经典的、与Dicer无关的途径，在细胞质中由Ago2通过裂解第10/11位的3’-发夹茎直接处理，然后由Poly（A）特异性核糖核酸酶（PARN）修剪。MiR451类似物被发现是独立于Ago1、Ago3或Ago4的，这减少了它们对内源miRNA的竞争和脱靶的可能性，从而提高了其安全性。例如，Ago2-sliced agshRNAs，使用一个引导序列，形成一个17-18bp的茎和一个4nt的环。

在他们目前的研究中，Alsing及其同事生成并直接比较了Vegfa靶向shRNAs以及基于miR451或miR324的相应的agshRNAs。正如所希望的那样，在培养的细胞中，agshRNAs显示出（1）对反义靶点没有可检测的客体链活性，（2）与内源性miRNAs的竞争减少，以及（3）与shRNA对应物相比，LV转导后的毒性部分减少。竞争和毒性都受特定靶标序列的影响，而不是受RNAi效应物结构的影响。有趣的是，通过将agshRNAs嵌入miRNA骨架（miR-agshRNAs），将agshRNAs的表达从U6切换到RNA pol II启动子时，这两种副作用都被取消了。然而，这是以降低敲除效率为代价的。为了证明miR-agshRNAs在体内的适用性，Alsing等人选择了他们以前用于基于miRNA的Vegfa敲除的RPE特异性VMD2启动子。然而，整体转导效率太低，在没有事先对转导细胞进行荧光激活细胞分选的情况下，无法检测出效应物诱导的基因敲除。

为了进一步研究对细胞转录组的影响，Alsing等人用含有U6启动子驱动的表达盒的LV载体转导ARPE19细胞，用于三个相应的shRNA/agshRNA对。使用RNAseq结合不同调控基因的聚类，通过基因本体的富集和七聚体种子匹配分析，这使得不同效应物引起的几个副作用得到了确认。这些结果进一步说明了agshRNAs的优点，如减少由客体链种子介导的脱靶敲除，它们还揭示了序列特异性的脱靶效应，这些效应在具有共同引导链的sh-和agshRNAs之间共享。

总的来说，这项工作完美地说明了RNAi领域不断取得的显著进展，并最终将有助于缩小其临床转化的差距。从（1）经典的U6启动子驱动的shRNAs及其体内毒性倾向，到（2）乘客链活性降低和内源性miRNA竞争的amshRNAs，这里报告的（3）由组织特异性RNA pol II启动子驱动的miRNA嵌入的新类别有望在RNAi特异性和安全性方面实现又一次飞跃（图1）。然而，许多观察到的副作用被发现取决于引导链的序列，因此，未来的迭代完全可以比较多个不同的效应物序列，以确定结合强大的目标击倒和最小副作用的候选物，并阐明基本的设计规则。值得注意的是，目前作者已经成功地证明了转录组分析对于分层的价值，可以全面地了解特定RNAi效应物所引起的副作用。在未来，将非效应物对照作为RNA pol II或pol III驱动的RNAi系统引起的固有转录组变化的参考，将是有趣和有意义的。最后，正如VMD2启动子驱动的miR-agshRNAs通过LV载体在体内的应用所证明的那样，实现治疗性敲除需要高效的载体以及强大的RNAi效应物和强大的表达系统。很明显，这些组件中的每一个都需要进行关键的剖析、平衡和微调，以使足够的敲除效率与最大的安全性并存。为此，本研究的优点之一是我们现在有了一个扩大的工具集，可用于研究、比较和优化体外和体内的所有这些参数，这将最终有助于加速临床RNAi的转化。

原文链接（文中图片均来源于该论文）：

https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.03.027