玩转Sanger测序仪丨专题五：呼吸道病原体多重核酸检测
急性呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，是威胁人类健康最常见的疾病之一，导致急性呼吸道感染的致病微生物包括病毒、细菌、真菌、支原体和衣原体等。
急性上呼吸道感染（upper respiratory tract infection，URTI）
是由各种病毒和/或细菌引起的主要侵犯鼻、咽或喉部急性炎症的总称，包括普通感冒、病毒性咽炎、喉炎、疱疹性咽峡炎、咽结膜炎、细菌性咽-扁桃体炎。上呼吸道感染致病微生物中70%~80%是病毒，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒、副流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、肺炎支原体和衣原体；少数为细菌感染，约占20-30%。
下呼吸道感染（lower respiratory tract infection，LRTI）
主要包括社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，6%~61%是病毒。其中，CAP的致病微生物中2%~30%是病毒。随着人口老龄化及免疫抑制宿主增多，肺炎发病率及病死率会继续升高。
急性呼吸道感染对儿童健康造成严重威胁
急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病，是5岁以下儿童病死的首位原因，呼吸道感染的病原复杂多样，其中呼吸道病毒是婴幼儿乃至学龄前儿童 CAP 的常见病原。
年龄越小，发生病毒感染的比例越高，特别是在＜2岁的婴幼儿，病毒性病原高达80%～90%。据统计，每年儿童发生病毒性呼吸道感染的中位次数是5次，更有10%的儿童每年发生多达10次以上的呼吸道病毒感染。
据世界卫生组织统计，每年因呼吸道病毒感染造成的社区获得性肺炎达2亿人次，其中1.5亿儿童患者为发展中国家的儿童，其中重症病例＞1460万例，死亡儿童＞100万例。
同时，呼吸道病毒感染也可以导致多种并发症，包括中耳炎、鼻窦炎和继发细菌感染等。尤其重要的是，呼吸道病毒感染是儿童哮喘急性发作最为重要的诱因之一：呼吸道病毒感染占3岁以下儿童喘息发作诱因的90%以上；即使在学龄儿童，呼吸道感染也占其哮喘急性发作诱因的80%～85%。研究表明，不同年龄组下呼吸道感染患儿中，病毒及非典型病原体检出率均较高（图1）。
成人呼吸道感染也不容忽视
成人急性呼吸道病毒感染一般与年龄、性别、季节及环境等因素存在密切关系，人群普遍易感，多可自愈，但重症急性呼吸道感染患者的病死率和致残率会显著升高，早期识别重症感染的高危因素并积极进行治疗就极为重要。
成人重症急性呼吸道病毒感染的高危因素包括：(1)年龄≥65岁；(2)男性；（3）吸烟；（4）患有至少1种慢性基础性疾病或恶性肿瘤、免疫功能抑制；(5)体质量过轻（BMI<18.5）或肥胖（BMI>30）；(6)妊娠期妇女；（7）用药时间延迟。
研究 1
2009年12月至2014年6月，中国10省(市)流感哨点监测医院纳入的≥15岁的3071例严重呼吸道病毒感染患者的流行病学和临床信息调查发现，起病至入院时间>7 d、哮喘、免疫抑制疾病或妊娠是流感重症的高危因素。此外，肥胖[体质量指数(BMI)>30]也是重症急性呼吸道感染的高危因素，其使ICU入住风险或死亡风险增加2倍。
研究 2
在一项Meta分析中发现，男性、年龄大于65周岁、吸烟、合并有一种基础疾病如高血压、糖尿病、心血管疾病和呼吸系统疾病的COVID-19患者发展为重症甚至死亡的风险显著升高，肿瘤患者尤其是在COVID-19起病4周内接受过化疗者也是发展为重症的高危因素。
呼吸道病原体混合感染的影响
呼吸道标本中多种病原体核酸共检出（co-infection）为临床感染病原体的诊断带来挑战。有研究显示，儿童急性下呼吸道感染病例呼吸道标本中病毒核酸混合检出的比例达35.6%，年龄越小，混合检出的比例越高。另外，呼吸道是一个开放的系统，且本身存在一些定植细菌，呼吸道上皮细胞和淋巴细胞中可能存在潜伏感染的病毒，这些病原微生物在呼吸病毒感染、上皮受损、机体免疫紊乱的情况下，均可能参与呼吸道感染的致病进程。
研究 1
2010-2015年，Han M S 等人纳入286例住院的肺炎支原体肺炎患儿，通过RT-PCR进行检测，回顾性分析支原体肺炎患者混合/单一感染病毒的临床表现。在286名肺炎支原体肺炎患儿中，有29.4%同时检测到呼吸道病毒，其中幼儿的混合感染检测率最高（2岁以下儿童的51.9% ；P=0.002）。在2岁以下的患儿中，混合感染（肺炎支原体&其它病毒）和单一感染（肺炎支原体）的喘息发生率分别为35.7%和15.4%。
研究 2
2014年，温州医科大学附属第二医院育英儿童医院对992例因LRTI住院的5岁以下患儿，采用多重PCR技术检测儿童下呼吸道感染病毒和非典型性病原体，结果显示：992例患儿中，851例患儿的鼻咽分泌物标本至少存在一种病原阳性（占85.8%），224份标本（占22.6%）检测到两种或两种以上病原。其中，RSV和HRV占所有检测病原的前两位。＜1岁组和1~3岁组的混合感染率均高于3~5岁组。
最新研究 | 儿童早期呼吸道感染与成年后死于呼吸系统疾病的风险较高有关
2023年，英国帝国理工学院James Peter Allinson团队在顶级医学期刊《柳叶刀》发表了一项对3589名参与者跨越80年的出生队列研究。研究发现：
（1）与没有感染的参与者相比，在儿童早期发生下呼吸道感染与在73岁前因呼吸道疾病而过早死亡的风险升高93%有关（p=0.021），而与癌症等其他相关死亡之间没有显著相关性。
（2）儿童早期下呼吸道感染发生三次及以上与成年后呼吸道原因死亡的风险增加187%相关，1岁前发生下呼吸道感染与成年后呼吸道原因死亡的风险增加112%相关，而需要住院治疗的下呼吸道感染与成年后呼吸道原因死亡的风险增加335%相关。
慢性呼吸系统疾病是一个重要的公共卫生问题，据估计，2017年有390万人因慢性呼吸系统疾病死亡，占全球死亡总数的7%，而慢性阻塞性肺病（COPD）是导致这些死亡的主要原因。婴儿LRTI与成年后肺功能损害、哮喘和COPD的发病有关，但之前尚不清楚其是否与成年后过早死亡有关。可以说这项研究是提供了迄今为止最好的证据，表明早期呼吸系统健康对后期的死亡有影响。如果可以预防儿童在2岁之前发生下呼吸道感染，就有望降低他们成年期的过早死亡率，减轻低收入和中等收入国家的儿童下呼吸道感染负担。
呼吸道感染病原体核酸检测
01 核酸检测适用于感染早期诊断，满足临床精准诊疗需求
02 多份指南与政策文件推荐使用多重核酸检测
03 多项临床指南：重视免疫低下患者的呼吸道多重病原体检测
《免疫缺陷成人社区获得性肺炎治疗策略共识》（CHEST，2020）
呼吸道病毒是免疫抑制成人患者发生社区获得性肺炎的主要病原体之一。常见的呼吸道病毒包括流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒。
以下免疫功能低下患者患CAP风险高：
● 肿瘤、接受器官移植
● 免疫系统受损
● 使用免疫调节疗法的非恶性肿瘤患者
● 使用新型免疫调节药物
● 免疫功能低下患者占CAP住院患者的20%-30%
《2021 ATS临床实践指南》
以下患者推荐病毒多重核酸检测：
● 重症CAP患者
● 免疫功能低下的患者（包括中性粒细胞减少症、正在接受积极的癌症治疗，那些有实体器官或血液成分移植史者，患有晚期 HIV 疾病，或那些有长期使用免疫抑制药物，包括全身性皮质类固醇）
《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》（2016版）
呼吸道病毒在 CAP 中起着重要作用，可以是 CAP 的直接病原体，也可以使患者易于继发肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等细菌性肺炎。我国免疫功能正常成人 CAP 患者检测到病毒的比例在15%~34.9%之间，常见病毒有流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。
Sanger测序仪T400助力呼吸道病原体多重检测解决方案
Sanger测序仪T400是一款体积小巧的创新卡夹式测序仪，基于毛细管电泳平台技术，可帮助客户在实验室开展Sanger测序和片段分析工作，覆盖包括感染性疾病、肿瘤、生殖健康及药物基因组学检测等临床领域，是核酸检测“金标准”平台。
毛细电泳片段分析+多重引物设计+先进的扩增体系（含防污染和多重质控），实现真正意义上的单管多重。
技术原理：多重荧光片段分析技术通过将多重荧光PCR和毛细管电泳分离技术巧妙的结合，可在一个反应中同时对多种PCR产物进行定量分析。具体来讲，同一个PCR反应体系中包含多对荧光标记的引物，各引物特异性地结合相应的目的基因，扩增产生不同长度的片段；通过毛细电泳系统对不同片段长度的PCR产物进行分离和识别，从而对病原体进行鉴别检测。
检测靶点：1份标本一次检测13个靶点（可区分亚型），覆盖近80%的常见呼吸道感染病原。
检测结果示意图
将电泳数据导入数据分析软件，选择相应的panel，分析软件会根据目标片段大小和设定的靶点区域，对其进行靶点标定。结果清晰直观，易学易用。
适用人群：
● 呼吸道症候群患者
（1）就诊科室：呼吸科、儿科、急诊科、感染科；
（2）患者特点：出现发热、咳嗽、咽痛等呼吸道症状的患者，比如：社区获得性肺炎、慢阻肺急性加重、哮喘急性加重等；
（3）检测获益：全面筛查、新冠鉴别；早期诊断、精准治疗；疾病预期、多重识别；流感监控、院感无忧。
● 免疫功能低下患者
（1）就诊科室：血液科、肿瘤科、肾内科、风湿科；
（2）患者特点：移植、透析、放化疗、长期使用激素等免疫抑制剂，易并发呼吸道感染的患者；
（3）检测获益：全面筛查、院感无忧；早期识别病毒感染风险、延缓疾病进展；减少肺部并发症，降低死亡率。
参考文献及资料
[1]成人急性呼吸道病毒感染急诊诊疗专家共识.中华急诊医学杂志, 2021,30(12): 1417-1428.
[2]Treatment of community-acquired pneumonia in immunocompromised adults: a consensus statement regarding initial strategies. Chest, 2020.
[3]Nucleic Acid–based Testing for Noninfluenza Viral Pathogens in Adults with Suspected Community-acquired Pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2021.
[4]中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版).中华结核和呼吸杂志,2016.
[5]儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识，中华实用儿科临床杂志，2022
[6]James Peter Allinson,et al.Early childhood lower respiratory tract infection and premature adult death from respiratory disease in Great Britain: a national birth cohort study.THE LANCET，2023.
[7]崔贤艳,吴勇.多重荧光PCR毛细电泳片段分析技术研究与临床应用，临床实验室丨实验室诊断技术导航.
[8]Nuceic Acid-based testing for Noninfluenza Viral Pathogens in Adults with Suspected Community-acquired Pneumonia.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2021.
[9]《2022年国家医疗质量安全改进目标》，2022.
[10]《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》，2022.
