USP10-HDAC6轴在缺乏野生型p53的非小细胞肺癌中赋予顺铂耐药性

写在前面

        今天推荐的是由韦恩州立大学Karmanos癌症研究所在2020年5月7日发表于Cell Death & Disease（2020IF：8.469，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Xiaohong Mary Zhang教授，研究表明USP10-HDAC6轴在缺乏野生型p53的非小细胞肺癌中赋予顺铂耐药性。

研究背景

        泛素特异性肽酶10（USP10）属于USP家族。由于其相关蛋白和底物的多样性，USP10在癌症中的作用仍然难以捉摸。先前的研究表明USP10能够稳定肿瘤抑制基因和癌基因。然而，USP10在非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的作用的性质仍不清楚。

摘要部分

        通过分析癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库，作者发现高水平的USP10与具有突变p53的NSCLC的总体生存率较差相关，但与野生型p53无关。USP10的敲低或药理学抑制显着降低了缺乏野生型p53的肺癌异种移植物的生长，并使它们对顺铂敏感。从机制上讲，USP10与致癌蛋白组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）相互作用，去泛素化，并使其稳定。此外，将USP10或HDAC6重新表达到USP10敲低的NSCL CH1299细胞系中，会导致其对顺铂产生抗性。该结果表明存在“USP10-HDAC6-顺铂耐药性”轴。在临床上，作者发现USP10和HDAC6表达在一组NSCLC患者样本中呈正相关。此外，作者已经表明，在接受铂类化疗的晚期NSCLC患者中，高水平的USP10 mRNA与较差的总体生存率相关。总体而言，作者的研究表明，USP10可能是预测患者对铂类反应的潜在生物标志物，靶向USP10可使缺乏野生型p53的肺癌患者对铂类疗法敏感。

研究内容

1.USP10与HDAC6相互作用       

        为了研究USP10在肺癌中的作用，作者采用了蛋白质纯化方法。作者发现了68个USP10结合蛋白。从上述分析中鉴定了一种HDAC6肽。为了进一步证实这种相互作用，作者在H23 NSCLC细胞系中免疫沉淀了内源性HDAC6和USP10。另一方面，抗HDAC6抗体能够免疫沉淀USP10。这些结果证实了内源性USP10和HDAC6在肺癌细胞中相互作用。

        为了确定USP10是直接还是通过其他蛋白质与HDAC6结合，纯化的GST-USP10和His-HDAC6能够在无细胞条件下通过GST pull-down试验相互作用，表明USP10和HDAC6之间存在直接相互作用。接下来，作者映射了HDAC6的哪些域与USP10结合。HDAC6的两个全长催化域：N端DAC1和中央DAC2与USP10结合。

研究结论：USP10与HDAC6之间发生相互作用。

2.HDAC6是USP10的新底物   

        作者发现只有野生型USP10，而不是催化缺陷突变体（USP10/C424A）在293T的表达，显着增加了HDAC6的内源性水平，表明USP10的去泛素化酶活性对于增加HDAC6的蛋白质水平是必不可少的。为了验证USP10在调节HDAC6蛋白水平中的作用，作者接下来在不同细胞中敲低USP10，并观察到 HDAC6蛋白在四种NSCLC细胞系以及两种卵巢细胞系中的表达显着降低。作者还发现HDAC6的mRNA水平不受USP10敲低的影响，表明USP10对HDAC6的调节不是通过转录。

        作者随后探究癌细胞系中USP10和HDAC6表达之间的相关性，结果发现HDAC6蛋白水平与几种肺癌细胞系和卵巢癌细胞系中的USP10蛋白水平呈强正相关。为了验证USP10通过去泛素化并因此稳定HDAC6上调其表达，作者通过用蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (CHX) 处理USP10野生型和USP10敲除MEF，结果发现CHX处理使HDAC6蛋白水平随时间快速下降。类似地，与对照细胞相比，H23 NSCLC细胞中USP10的敲低缩短了HDAC6的半衰期。一致地，USP10与其特异性抑制剂 Spautin-1的直接抑制也导致HDAC6的蛋白质半衰期显着缩短。

研究结论：USP10增加了HDAC6蛋白质的稳定性。

        与对照 H23 细胞相比，USP10的敲低降低了HDAC6蛋白水平，而 MG132（蛋白酶体抑制剂）回补了敲低细胞中HDAC6的表达，表明阻断蛋白酶体降解导致HDAC6积累。接下来，作者测试了USP10是否可以去泛素化HDAC6。结果发现野生型USP10显着降低了293T细胞中的HDAC6泛素化。为了排除USP10相关蛋白作为HDAC6的DUB的可能性，使用纯化的USP10及其突变体和泛素化HDAC6蛋白作为底物进行了体外去泛素化测定。野生型USP10有效地从HDAC6中去除了多聚泛素链。为了进一步辨别USP10去除的HDAC6上多聚泛素链的连接，作者利用了泛素链连接特异性抗体。H1299 细胞中USP10的敲低显着增加了HDAC6中K48连接的多聚泛素链的存在，作者的结果证实了USP10从HDAC6中去除泛素链的观点，这反过来又稳定了HDAC6。

        为了鉴定HDAC6泛素化位点，作者在293T细胞中共过表达HDAC6和泛素，然后用 MG132 处理。泛素化HDAC6被免疫沉淀并在SDS PAGE上解析，泛素化HDAC6条带进行质谱分析。结果显示HDAC6在三个赖氨酸残基处泛素化：K51、K116 和 K849。与野生型HDAC6相比，K51R、K116R 和 3KR 突变体而非 K849R 突变体的泛素化水平显着降低，表明K51和K116 是体内主要的泛素化位点。

研究结论：USP10是一种HDAC6去泛素酶，它可以通过去除HDAC6在特定赖氨酸残基（包括K51和K116）上的K48连接的多聚泛素链来延长HDAC6的稳定性。

3.USP10的敲低或抑制使携带突变或无效p53的NSCLC细胞和卵巢癌细胞对顺铂敏感     

        之前的研究表明HDAC6在NSCLC细胞系中赋予顺铂耐药性。因为USP10稳定HDAC6，作者探究USP10是否通过HDAC6赋予顺铂耐药性。作者在NSCLC和卵巢癌细胞系中去除了USP10，并用载体或顺铂处理它们以通过MTT测定检查细胞活力。在USP10敲低后，含有无效突变体-p53的六个细胞系对顺铂敏感，而含有野生型p53的这三个细胞系在USP10敲低后，对顺铂具有抗性。与单独的P22077或顺铂处理相比，P22077和顺铂处理的组合显着降低了细胞活力。这一结果证实了USP10的敲低或抑制使含有无效或突变p53的肺癌或卵巢癌细胞对顺铂敏感的观点。

        为了确定p53是否是USP10敲低后顺铂敏感性的决定因素，作者使用了一对A549对照和A549-p53敲除细胞系。USP10的敲低使A549-p53 KO细胞致敏，但A549对照细胞不致敏。该结果表明在p53缺失背景中选择性靶向USP10会使癌细胞对顺铂敏感。

研究结论：USP10的敲低或抑制使携带突变或无效p53的NSCLC细胞和卵巢癌细胞对顺铂敏感。

        作者接下来检查了USP10敲低和顺铂治疗对长期细胞存活的影响。为此，作者使用三对对照和USP10稳定敲低NSCLC细胞系（H157、H23和H1299）和两对对照和USP10稳定敲低卵巢癌细胞系（SKOV3和ES-2）进行了集落形成分析，这些细胞都含有正常或突变的p53。USP10的稳定敲低使所有细胞系对顺铂非常敏感。为了确定USP10活性的抑制是否会达到与USP10敲低相似的结果，作者用USP10抑制剂Spautin-1处理三种NSCLC细胞系，以及用USP10抑制剂P2207714处理H1299。顺铂联合USP10抑制剂抑制集落生长的作用大于单独使用顺铂或USP10抑制剂，表明靶向USP10的活性将使NSCLC细胞对顺铂敏感。

        随后，为了确定USP10敲低诱导的顺铂敏感性增加是否是由于细胞凋亡，作者检查了两种NSCLS细胞系H157和H23中的PARP-1裂解。正如预期的那样，在USP10稳定敲除的H157细胞系中，与对照敲除的细胞相比，裂解PARP-1的水平以顺铂剂量依赖的方式升高了。因此，USP10可能会降低顺铂敏感性并通过HDAC6发挥致癌作用。为此，作者将HDAC6或USP10重新引入到USP10敲低的H1299细胞中。结果发现USP10敲低细胞中HDAC6或USP10的过表达显着增加了顺铂处理后的细胞存活率并减少了细胞凋亡，如裂解的PARP-1水平所示。

研究结论：存在一个USP10-HDAC6轴，该轴在决定顺铂敏感性和野生型p53缺失时USP10的致癌功能方面起着至关重要的作用。

4.USP10的敲低或抑制会降低异种移植物的生长并使异种移植物对顺铂敏感     

        作者随后探究在缺乏野生型p53的癌症中USP10的缺失是否会减少肿瘤发生并增加体内化学敏感性。为了研究USP10敲低对体内肿瘤生长的影响，作者在免疫缺陷小鼠中接种了四对对照和USP10敲低癌细胞，并测量了异种移植物随时间推移的生长情况。在测试的所有四种细胞系中，USP10的缺失显着减小了肿瘤大小。一致地，在USP10敲低SKOV3和ES-2异种移植物中，肿瘤重量显着降低。这些结果表明USP10的敲低抑制了体内肿瘤的生长。然后作者开始探究USP10的敲低是否使肺癌异种移植物对顺铂敏感。USP10的敲除大大减少了异种移植物的生长，并且与顺铂治疗相结合几乎完全消除了肿瘤的发生。

        此外，作者还观察到USP10的敲低显着降低了 H1299、SKOV3（p53-null）以及 H23、ES-2 和 H157（p53-突变体）的异种移植物生长，但不会显着降低A549（p53-野生型），表明p53是USP10介导的体内生长的决定因素。作者接下来评估了USP10抑制剂对鼠异种移植肿瘤的潜在治疗益处。为此，作者使用p53缺陷型NSCL CH1299细胞系在体内测试了USP10抑制剂P22077。单独使用顺铂或P22077的单药治疗导致对肿瘤生长的显着抑制，而P22077与顺铂组合显示出对肿瘤生长更为有效的抑制。在所有治疗组的任何小鼠中均未观察到体重减轻，这表明P22077单独或与顺铂组合的剂量对小鼠无毒。

研究结论：敲低或抑制USP10可抑制肺癌和卵巢癌异种移植的生长，并使异种移植对免疫缺陷小鼠的顺铂治疗敏感。

5.USP10和HDAC6在肺癌和卵巢癌中均高度表达；在接受铂类治疗的NSCLC患者中，高水平的USP10与较短的总生存期相关     

        为了进一步验证作者在人类癌症患者样本中的发现，作者首先使用数据库Oncomine 分析了正常或选定癌症组织中USP10表达的变化。结果显示，与正常组织相比，USP10的mRNA水平在NSCLC的三种组织学亚型以及卵巢癌中明显过表达。在上述研究中，作者在17个肺癌和卵巢癌细胞系中显示出USP10和HDAC6之间的强正相关。为了进一步证实这种表达模式以及临床组织标本中USP10和HDAC6之间的关系，作者进行免疫组织化学 (IHC) 染色以评估这些患者样本中的USP10和HDAC6表达水平。结果显示，与正常组织相比，癌症患者样本中USP10和HDAC6的表达均显着增加。

        接下来，作者检查了USP10的水平是否可以预测NSCLC患者的铂类反应。在42名接受铂类治疗的患者队列中，USP10的高mRNA水平对总体生存率产生不利影响。总体而言，USP10是一种潜在的预测性生物标志物。为了检查USP10表达对p53突变NSCLC患者的影响，作者使用了来自TCGA的964名患者队列。高水平的USP10 mRNA与p53突变体中较低的OS相关，但与p53野生型队列无关，这表明USP10是具有p53突变的NSCLC子集中的潜在靶标。

研究结论：在肺癌和卵巢癌患者样本中，USP10的mRNA和蛋白水平都有所增加；USP10 mRNA水平高与接受铂金治疗的晚期NSCLC患者的总生存率差有关。

结论与讨论

        总之，作者的研究表明SKP2介导了K63相关的泛素化和Bcr-Abl的激活，以增强Bcr-Abl信号传导。此外， USP10是SKP2的新型DUB，它可能与USP13一起发挥作用，介导对抗泛素化和SKP2降解的对抗作用，从而确保SKP2的高蛋白质水平和增强的Bcr-Abl信号传导。作者的发现这为细胞周期控制的失调提供了新的见解。本研究还确定了以USP10为靶点治疗CML的潜在可行的治疗策略。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-020-2519-8