【青莲客户文章】在工程大肠杆菌中通过葡萄糖和甘油的同时转化可持续生产糖蛋白
细菌糖工程用于生产治疗性糖蛋白已经成为一种有效的策略。与传统化学和化学酶过程需要复杂的偶联步骤相比，细菌“活细胞工厂”可以直接在体内生物合成糖蛋白，避免了致病菌的大规模发酵，简化了制造过程。此外，在微生物发酵过程中可以实现低成本、短时间和高细胞密度生产目标糖蛋白，因此开发高效经济环保的糖蛋白生产平台具有很大发展潜力。
近日，来自南开大学的青莲百奥合作客户在《Green Chemistry》期刊上发表了一篇题为“Sustainable production of a polysaccharide-based glycoprotein by simultaneous conversion of glucose and glycerol in engineered Escherichia coli”的研究文章。在这项研究中，通过细菌糖工程技术改造大肠杆菌并优化发酵条件生产目标糖蛋白，开发了可持续、高效绿色的糖蛋白生产平台。
【标题】Sustainable production of a polysaccharide-based glycoprotein by simultaneous conversion of glucose and glycerol in engineered Escherichia coli
【期刊】Green Chemistry（IF=9.8）
【见刊时间】2023.05
研究背景
尿路感染(UTI)是一种由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)引起的传染病，然而普遍的血清群O4对大多数抗生素耐药，因此研究针对O4血清群的保护性疫苗具有重要意义。基于糖蛋白开发抗菌疫苗有良好的前景，但是需要复杂的连接策略和化学试剂，且目前化学酶合成成本高且对环境不友好。开发高效可持续、环境友好的糖蛋白制造平台具有很大应用潜力。
研究思路
本研究通过高协同代谢效率的葡萄糖/甘油混合物偶联，开发了O -糖基化大肠杆菌底盘，安装O-抗原基因簇以生物合成糖蛋白。随后，通过调节相应酶的表达和优化发酵条件提高糖蛋白的表达量。质谱验证目标糖蛋白的生物合成和高效糖基化（青莲百奥提供技术服务），最后在小鼠模型中评价糖蛋白的免疫保护性。
研究内容
一、大肠杆菌的O-抗原多糖糖工程技术
为了构建多糖合成途径，通过PCR鉴定尿路致病性大肠杆菌O4 O-抗原基因簇rfb的结构，与之前的报告类似。在野生型MG1655中观察到脂质A，并不是LPS的最佳结构，表明OPS4的异源生物合成被阻断。野生型大肠杆菌MG1655中存在的一些天然代谢途径可能会干扰OPS4的生物合成。因此需要一个优化的糖工程底盘，通过删除参与竞争性生物合成途径的基因来提高OPS4的生物合成效率。
二、大肠杆菌底盘菌株的设计和构建以提高OPS4的产量
本研究的核心目标是高效合成基于OPS4的糖蛋白，通过从大肠杆菌MG1655中删除了32个与竞争途径相关的基因，并引入了28个与糖蛋白生物合成相关的基因，从而成功地生产了目标重组糖蛋白。
三、增强细胞内NDP糖前体的生物合成以增加糖蛋白的产生
通过组合不同强度的启动子可以实现基因表达的微调，提高生物合成效率。通过组合三种不同表达强度的启动子(强:J23119，中:J23108，弱:J23113)，调节dTDP-L-Rha和UDP-L-FucNAc通路的表达水平。构建18个质粒变体分别导入TD14中产生糖蛋白，菌株AGO08的蛋白质和糖含量最高，其次是AGO10。因此在18株重组菌株中，选择AGO08和AGO10进行进一步优化。
四、质谱法评价糖蛋白糖基化
采用质谱法对重组糖蛋白进行定性和定量分析。对照菌株TD14和高产菌株AGO08纯化后的糖蛋白经SDS-PAGE分离，经GluC处理进行LC-MS/MS分析。与TD14的糖蛋白相比，AGO08的糖蛋白出现了6种类型的修饰，这表明基因表达的微调不仅可以增加NDP糖的供应，还可以增加聚糖密度，从而提高糖蛋白的生物合成效率。
五、优化培养条件使糖蛋白产量最大化
为了进一步提高糖蛋白的产量，在诱导过程中通过改变IPTG浓度、诱导温度和细胞密度来优化培养条件。在28℃、OD600 = 0.6、1.5 mM IPTG条件下，发酵48 h后，AGO08产生的糖蛋白滴度为27.71±1.03mg L−1。
六、AGO08产生的糖蛋白可诱导保护性免疫反应
为了检验CTB-O4糖蛋白是否能增强对UPEC -O4的保护作用，按预定时间免疫各组小鼠，检测UPEC-O4 -小鼠UTI模型特异性IgG抗体反应。值得注意的是，用糖蛋白免疫的小鼠比其他两组产生更高水平的特异性IgG。然后评估CTB-O4糖蛋白对肾脏和膀胱中细菌的清除能力。在UPEC-O4攻击48小时后，糖蛋白接种小鼠的肾脏细菌负荷比PBS接种小鼠减少了44倍，比CTB接种小鼠减少了20倍。在膀胱中，糖蛋白给药组细菌数量比单独给药CTB减少26倍，比单独给药PBS减少41倍。结果表明糖蛋白可以增强免疫原性，并对肾脏感染提供有效的保护。
研究总结
该研究通过对大肠杆菌改造，提高NDP前体的生物合成及优化发酵条件产生目标糖蛋白。小鼠模型验证糖蛋白针对UPEC有良好的免疫保护性。该研究为开发可持续、环境友好型的高价值治疗性糖蛋白制造平台提供了指导。
