上交瑞金医院等团队拿下16分+！肿瘤免疫预后还得看单细胞分析！

都说科研难、科研苦，等结果的过程堪比漫漫取经路。不过，要学会换个角度、换个方向重新看问题就会柳暗花明又一村。 相信单细胞测序大家都早有耳闻，近几年热度持续上升。那会不会已经没什么可以创新的思路了呢？当然不是，只要你在PubMed数据库搜索，就会发现，依据单细胞测序可以有大量不同的新颖的角度。不仅要测序，后续的分析更加重要。即通过转录组测序技术，对单个细胞内的基因表达进行分析。其目的是揭示生物体内基因表达的差异性，进而了解细胞命名的遗传调控过程，在细胞水平内全面控制分子机理，实现自发发育、差异发育、性状表达和适应环境等生命特征和特性。目前被广泛运用于医学领域。例如对于癌细胞，细胞种群相互之间的异质性及其在癌症内部随时间和治疗进展而发展的进化对于洽疗方案的制定和影响是至关重要的。 小云苦苦寻找了一篇典范就赶紧和大家一起分享了。这篇文章通过单细胞测序的结果进行了肿瘤细胞亚群分类鉴定，然后通过一系列GO富集分析、细胞间通讯分析、生存分析以及可视化分析和统计分析T细胞B细胞串扰所促进的独特免疫特征，建立了一种能够有效预测癌症患者预后状态的预后标志。这为癌症提供了更好的预后信息和有效的治疗靶点。具体的分析过程快和小云一起往下学习吧！

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题目：单细胞图谱揭示了三阴性乳腺癌中T细胞-B细胞交叉作用的独特免疫谱

杂志：Cancer Communications

影响因子：IF=16.2

发表时间：2023年6月

研究背景

免疫疗法正在成为实体瘤中有希望的治疗选择。由于免疫治疗的抗肿瘤作用与肿瘤免疫微环境（TME）密切相关，因此解剖复杂且异质的TME是找到合适的治疗靶点和提高免疫治疗的临床疗效的基础。表征每种肿瘤独特的免疫微环境对于更好地预测预后和指导癌症免疫治疗具有重要意义。然而，与乳腺癌的其他亚型相比，三阴性乳腺癌（TNBC）的免疫微环境的独特特征仍然难以捉摸。因此，作者旨在描述和比较TNBC、人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）乳腺癌和管腔样乳腺癌之间的免疫景观。

数据来源

研究思路

对从人正常乳腺组织和各种亚型的原发性乳腺肿瘤中分离的CD 45+免疫细胞进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)。通过分析scRNA-seq数据，鉴定了免疫细胞簇，并在TNBC、人HER 2+乳腺癌和管腔样乳腺癌之间比较了它们的比例以及转录组特征。还进行了假时间和细胞-细胞通讯分析以表征免疫微环境。

研究结果

1.乳腺癌免疫细胞的群体特征和单细胞谱分析

将诊断为浸润性导管乳腺癌并经历乳房切除术的一组女性患者（n = 17）纳入本研究（图1A）。在40%的患者中确定了淋巴结阳性，60%的患者被分类为组织学III级。对于分子亚型，在该队列中有4名患者患有TNBC，6名患有HER 2

+

，7名患有管腔样乳腺癌。为了阐明具有不同分子亚型的乳腺癌的免疫景观，对通过FACS从该组中的一组21个新鲜切除的乳腺组织样品分离的CD45+免疫细胞进行scRNAseq：4例正常乳腺组织、4例TNBC、6例HER2+和7例管腔样乳腺癌（图1A）。获得了这些免疫细胞的总计117958个高质量的单细胞转录组。 如图1B所示，当将细胞投影到2D UMAP图中时，通过检查典型标志物基因来区分4个主要免疫细胞簇，包括T细胞、B细胞、NK细胞和骨髓细胞（图1C）。通过无监督聚类，将这4个细胞群进一步划分为31个免疫细胞亚群：11个T细胞簇、6个B细胞簇、6个NK细胞簇和8个骨髓细胞簇（图1D）。 为了揭示乳腺癌中免疫细胞图谱的异质性，比较了乳腺癌和正常组织的不同亚型中主要细胞群和亚群的比例。值得注意的是，B细胞主要在TNBC、HER 2

+

和管腔样乳腺癌中富集，但在正常组织中很少，平均比例分别为10.1%、12.3%和7.6%，而0.9%（图1E）。对独立的肿瘤和正常样品进行流式细胞术以验证scRNA-seq的发现。类似地，与TNBC、HER 2

+

和管腔样乳腺癌组织中的B细胞相比，正常组织中存在较少的B细胞（图1F）。关于亚群，发现较低水平的GZMB

+

细胞毒性CD8+ T细胞，但发现与正常组织相比，肿瘤中较高水平的F0XP3

+

Treg，表明乳腺癌中的抑制性TME（图1E）。这些发现也通过流式细胞术证实，其显示与肿瘤组织相比，正常组织中细胞毒性CD8+ T细胞的比例显著增加，而Treg的比例显著降低（图1F）。

图1不同亚型乳腺癌和正常组织中的免疫细胞景观

2. TNBC中T细胞介导的免疫抑制环境

在此鉴定了T细胞构成乳腺癌中最大的浸润性免疫细胞簇。在将93115个T细胞重新聚类后，基于其特征基因鉴定了总共11个T细胞簇，包括CD 4+区室中的6个簇和CD 8+区室中的5个簇（图2A-C）。值得注意的是，T细胞簇的分布模式在乳腺癌的各种分子亚型中是异质的（图2D）。与HER2

+

和管腔样乳腺癌相比，在TNBC中发现Treg和耗尽的CD8+ T细胞水平增加，表明免疫抑制环境。在外部scRNA-seq数据集中也验证了TNBC中Treg和耗尽的CD 8+T细胞的较高浸润水平。 Treg的转录组分析表明，与HER2+和管腔样乳腺癌中的那些相比，LGALS9、TNFRSF4、CD27和CD28的共刺激基因以及IL2RA、IL2RB、IL2RG、ENTPD1和LAG3的免疫抑制相关基因在TNBC中富集，表明TNBC中的Treg具有更显著的免疫抑制功能（图2E）。类似地，与HER2

+

和管腔样乳腺癌相比，TNBC中耗竭的CD8+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞表达更高水平的功能失调标签基因以及与耗竭相关的TF。这表明TNBC中CD8+ T细胞的耗竭程度更高（图2E）。与基因表达分析的结果一致，TNBC中T细胞的独特免疫抑制特征也通过Treg的显著更高的免疫抑制特征评分和耗尽的CD8+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞的更高的功能失调特征评分来反映（图2F）。

图 2乳腺癌和正常组织中不同分子亚型T细胞的组成和功能

3. TNBC中浆细胞的富集

作为在肿瘤和正常组织之间的比例方面具有最显著差异的细胞群，将B细胞进一步分成6个亚群，每个亚群具有其独特的标签基因（图3A-D）。当比较不同分子亚型中每个B细胞簇的比例时，作者发现TNBC表现出比HER 2+和管腔样乳腺癌显著更高水平的浆细胞（B_c05_Plasma_IGHG1）（分别为48.2%、1.5%和4.0%;图3E），这通过scRNA-seq数据集和流式细胞术分析（图3F）中的外部验证进一步证实。 为了确定B细胞簇的分化轨迹，进行伪时间分析。B细胞的假时间轨迹保留了两种分化途径（图4A），从初始B细胞开始，并且主要以记忆B细胞在一端结束，或浆细胞和浆母细胞在另一端结束（图4B）。虽然属于相同簇的细胞可以分布到不同的分化途径中，但分析显示根据伪时间顺序，从幼稚B细胞到记忆B细胞到最终以浆母细胞和浆细胞结束的连续过渡过程（图4C）。图4C中还显示了沿着该转变过程的差异表达的TF，如

BCL6

、

IRF4

和

E2F5

，并且可能是分化过程中的关键参与者。 根据在轨迹分支中的位置，将B细胞分成三组，称为预分支、路径I和路径II（图4D）。几乎所有的浆细胞和浆母细胞被归类为路径II，比例分别为95.2%和92.0%。有趣的是，在乳腺癌的所有亚型中均存在双途径分化模式，但分化模式不同（图4D）。TNBC中的B细胞倾向于从预分支分化到路径II，其中82.7%的B细胞分布在路径II中，并且4.4%的B细胞分布在路径I中。相比之下，HER2

+

和管腔样乳腺癌中的B细胞更可能从分支前分化为路径I而不是路径II，分别只有8.1%和11.5%的B细胞位于路径II中（图4D）。 鉴定了预分支、路径I和路径II的标签基因和富集的GO途径(图4E)。沿着两个不同的轨迹路径也观察到不同的基因表达模式(图4F)。沿着B细胞从预分支到路径I的细胞轨迹，与T细胞分化和白细胞细胞-细胞粘附相关的基因的表达水平逐渐升高(图4F)。另一方面，沿着B细胞从预分支到路径II的细胞轨迹，观察到富集B细胞活化、免疫球蛋白介导的免疫应答和Fcγ受体信号传导途径的基因的表达增加（图4F）。

图 4假时间分析定义了乳腺癌不同分子亚型中B细胞的两种分化模式

4. TNBC中明显的T细胞-B细胞串扰

为了确定驱动TNBC中上述不同T和B细胞浸润模式的潜在机制，研究了11个T细胞簇和6个B细胞簇中配体-受体对的表达水平以预测T细胞-B细胞相互作用。共分析了229个功能相关的信号通路，包括2021个经过验证的分子相互作用。结果显示，26种信号传导途径在T细胞-B细胞串扰中有活性，但这些信号传导途径的组成和相对强度因分子亚型而异。具体而言，CD86和CD39信号通路在TNBC中特异性地活跃，而CXCL信号通路主要来源于HER2+乳腺癌。然后系统地研究和筛选在TNBC中显著更突出的途径，其中基于29个配体-受体对的T细胞-B细胞相互作用大多在记忆B细胞之间富集，浆母细胞在一些实施方案中，所述细胞包括CD8+T细胞、CTLA 4+Tfh、Treg和耗竭的CD 8 + T细胞（图5A）。 通过评估与免疫调节功能相互作用的通讯概率（图5B）和配体-受体对表达水平（图5C-D），最终在5个簇中鉴定了7种富含TNBC的T细胞-B细胞相互作用，其可以促进TNBC中的不同TIME，其在索状图中突出显示。在本研究中，还预测浆母细胞（B_c06_PB_MKI67）经由

LGALS9-HAVCR2

对在TNBC中与耗尽的CD 8 + T细胞相互作用(图5B-C)。这种相互作用可能导致耗尽的T细胞的水平增加。此外，在作者的分析中鉴定的TNBC中的强CD27-CD70相互作用可以促进T细胞耗竭(图5B-C)。此外，先前已经报道，CD 39可以将细胞外ATP转化为细胞外腺苷（ADO），其可以联合收割机其受体

AD0RA2A

来启动免疫抑制性TME。作为TNBC中的排他性信号传导途径，CD 39信号传导途径使得记忆B细胞能够经由

ENTPDl(CD39)-ADORA2A

对与耗尽的CD 8+T细胞通信，这也可以促进TNBC中的免疫抑制(图5B-C)。这里，TNBC中的记忆B细胞高度表达

IC0SLG

和

CXCR5

，而TNBC中的Tfh细胞高度表达

IC0S

和

CXCL13

(图5D)。 总之，基于

IL16-CD4

、

LGALS9-HAVCR2

、

CD27-CD70

、

ICOSLG-CTLA 4

、

CD 86-CTLA 4

和

ENTPD 1

(CD 39)-

ADORA2A

对的TNBC中的特异性T细胞-B细胞串扰归因于免疫抑制性TIME，而突出的

ICOSLG-ICOS

和

CXCL13-CXCR5

相互作用帮助TIME建立B细胞分化成浆细胞的有利环境（图5E）。

图5细胞-细胞通讯分析表明TNBC中独特的T细胞-B细胞相互作用

5. TNBC中基于T细胞-B细胞串扰的预测签名

由于该研究的结果表明T细胞-B细胞串扰可能有助于形成TNBC中的不同TIME，因此假设T细胞-B细胞串扰中涉及的相关基因和细胞簇可能为TNBC患者提供重要的预后信息。因此，基于TNBC中的T细胞-B细胞串扰产生预后特征。 首先，评估METABRIC数据集中涉及的基因和细胞簇的预后价值，其中使用基于DEG的单细胞衍生的基因标记来估计不同细胞簇的浸润水平。结果表明，

CTLA4

、

ICOS

、

CXCL13

、CD4_c05-Tfh_CTLA4、CD4_c06_Treg_F0XP3、CD8_c10_exhauted_HAVCR2和B_C04_memory_ZBTB32与TNBC患者的无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）显著相关(图6A)。其次，根据基于上述七个预测因子的多变量考克斯回归分析，用三个选择的预测因子，即CTLA4、CD4_c06_Treg_CTLA4和B_c04_memory_ZBTB32构建TBCS。之后，将高风险组和低风险组之间的预后除以METABRIC数据集和外部验证数据集中TNBC患者的风险评分进行比较，以验证TBCS的预后值(图6B)。高风险组患者在METABRIC数据集中的RFS和OS显著更差，在外部验证数据集中的RFS更差(图6C)。在校正年龄、肿瘤大小、淋巴结状态和肿瘤分级后(图6D)，在两个RFS方面，高风险组中TNBC患者的预后比低风险组差。然而，TBCS未能预测患有HER2+乳腺癌（P > 0.05）或管腔样乳腺癌（P > 0.05）的患者的预后，表明TBCS的独特预后价值对于患有TNBC的患者是特别有益的。

图6基于TNBC中独特的T细胞-B细胞相互作用的预后特征的构建

6. TNBC中细胞毒性NK细胞和浆细胞样树突状细胞的富集

除T、B细胞外，NK细胞和髓系细胞在TNBC中的分布模式也与其他分子亚型的乳腺癌不同。将总共10676个NK细胞重新聚集成6个亚组，包括4个NK簇和2个NKT簇（图7A-D）。有趣的是，类似于正常组织，TNBC表现出相当高水平的细胞毒性NK细胞，但低水平的耗竭NK细胞，代表NK活性抗肿瘤环境。相比之下，HER2+和管腔样乳腺癌富含耗尽的NK细胞，但具有很少的细胞毒性NK细胞，表明它们的NK耗尽的前肿瘤环境(图7E)。这种不同的NK细胞浸润模式表明，TNBC患者由于基线时细胞毒性NK细胞水平相对较高，可能无法从NK靶向治疗中获益，这可能限制了药物进一步加强NK细胞抗肿瘤作用的能力。然而，基于NK的免疫疗法被建议用于开发HER2+和管腔样乳腺癌的合适治疗，因为它们的NK耗尽的微环境。

图 7与TNBC相比，HER2+和管腔样BC在NK细胞浸润中显示出不同的特征

研究结论

本研究通过单细胞谱分析，全面表征了TNBC与HER2+、管腔样乳腺癌和正常乳腺组织的不同免疫景观。TNBC具有独特的TIME，其特征在于T细胞介导的免疫抑制和大量浆细胞，可能由T细胞B细胞相互作用形成。建立TBCS来预测TNBC患者的预后。此外，本研究的发现提供了洞察未来免疫治疗策略的潜在靶点不同分子亚型的乳腺癌。 文章小结

通过这篇文章再次证明了解TIME对改善疾病预后和指导免疫治疗具有重要意义。在该研究中，发现TNBC具有明显的免疫抑制TIME特征，通过Treg和耗尽的CD8+ T细胞的富集所反映的，并且其伴随B细胞倾向于分化为浆细胞，这可能是由T细胞B细胞串扰驱动的。进一步生成TBCS用于TNBC预后的预测。本研究的结果不仅突出了乳腺癌各种分子亚型的不同特征，而且为基于NK的免疫治疗提供了一个有希望的研究方向，以延缓HER2+和管腔样乳腺癌的发展。文章选材新颖，论述详尽，各类分析均有涉及，体量较大。方法上有很多值得我们反复学习的地方。