高质量文章必备工具—光遗传学的研究应用
上星期小编为大家介绍了光遗传学技术（optogenetics）的发展、原理、常见光敏蛋白以及一般实验方法，该技术的出现很快成为了科研人员热衷的一门技术，推动了神经生物学的快速发展。相较于传统的神经科学研究，光遗传学拥有许多优势：
（1）高时空分辨率：光遗传能在时间和空间上特异性调控基因的表达；
（2）准确性：可以精确刺激指定的神经元；
（3）无损伤性：对实验动物的创伤远远小于传统方法，且没有异物侵入组织；
（4）高应用价值：可将光遗传技术应用到未曾可想的研究领域，像记忆神经学、其他组织器官研究及临床疾病治疗等。
当然，光遗传学技术还并不那么完美，目前仍存在一些局限性及亟待解决的问题：
（1）第一，光刺激水平可能会导致神经元反应超出生理范围，促使神经元下游的异常激活或抑制，出现不自然的神经回路响应，从而导致不正确的神经生理功能；
（2）第二，光照和光敏蛋白的表达可能并不统一在目标神经元细胞群中，导致光遗传学操作的幅度和空间范围产生异质性。例如光照在细胞表面产生散射，影响到附近非目标神经元；
（3）第三，对目标神经元细胞群进行大量且精确的刺激，有可能会促进神经回路进入非生理活动状态；
（4）第四，长期过表达外源性光敏蛋白造成轴突形态异常，是否会对神经环路产出潜在的影响，仍需要实验进一步仔细评估。
那么，光遗传学技术在研究中如何应用呢？小编整理了几个文献案例来跟大家分享下。
应用案例：
ChR2(H134R)—神经
文章标题：Transient, Consequential Increases in Extracellular Potassium Ions Accompany Channelrhodopsin2 Excitation【Cell Rep. IF=8.109，AAV，神经】
载体：AAV2/5- GfaABC1D-ChR2(H134R)-mCherry；AAV2/5- hsyn-ChR2(H134R)-YFP
病毒滴度：AAV2/5- GfaABC1D-ChR2(H134R)-mCherry（8.1×10^12 gc/ml）；AAV2/5- hsyn-ChR2(H134R)-YFP（2.9×10^12 gc/ml）
注射体积：1μl，200nl/min
注射部位：背外侧纹状体，浅表运动皮层
注射方式：脑立体定位注射
操作方法：473nm蓝光激活ChR2(H134R)，蓝光间隔10s照射10s，，持续60min
观察方式：选择性K+微电极，纹状体急性切片，小鼠行为学观察。
图1. AAV-ChR2表达后出现细胞外K+的短暂增加
ChR2(H134R)—心脏
发表文章：Optical Manipulation of Perfused Mouse Heart Expressing Channelrhodopsin-2 in Rhythm Control【Methods Mol Biol. IF=38.31，AAV，心脏】
载体：pAAV-CAG-hChR2(H134R)-mCherry
病毒滴度：1×1013 VG/mL
注射体积：150μl，共2.5×1012 gc
感染部位：小鼠心脏
注射方式：颈静脉注射
操作方法：473nm蓝光激活ChR2(H134R),强度5.52mW/mm2，10Hz持续20ms等。
观察方式：离体心脏，心脏WPI电极记录心脏MAP等。
图2. 小鼠离体心脏光刺激示意图以及心脏活动记录
C1V1
发表文章：Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction【Nature. IF=42.778，AAV，神经】
载体：rAAV5-CaMKIIaC1V1(E122T/E162T)-TS-mCherry
病毒滴度：(1.0-2.0)×1012 VG/mL
注射体积：600 nL
注射部位：小鼠皮质及丘脑
注射方式：脑立体定位注射
操作方法：561 nm黄光激活C1V1(t/t)，强度2 ms，2-3 mW，5 Hz，间隔20 ms，持续时间100 ms。
观察方式：免疫荧光、膜片钳电生理等。
图3. AAV介导C1V1(t/t)在前额锥体神经元中表达
ChETA和Arch
发表文章：Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and consciousness【Nature Neuroscience. IF=20.071，AAV，神经】
载体：AAVdj-ChETA-EYFP；AAV2-DIO-ArchT-EYFP
病毒滴度：＞1.0×1012 VG/mL
注射体积：600 nL
注射部位：小鼠丘脑
注射方式：脑立体定位注射
操作方法：473 nm蓝光激活ChETA，强度5 ms，25-30 mW，1/5/20 Hz，持续时间10s；593 nm黄光激活ArchT，强度5 s，25-30 mW，1/20Hz，无间隔，持续时间5s。
观察方式：免疫荧光、膜片钳电生理等。
图4. AAV-DIO-ChETA体内感染LHGABA神经元
图5. AAVdj-DIO-ArchT-YFP在体内感染TRNGABA神经元
eNpHR3.0
发表文章：Brief, but not prolonged, pauses in the firing of midbrain dopamine neurons are sufficient to produce a conditioned inhibitor【Journal of Neuroscience. IF=5.673，AAV，神经】
载体：AAV5-EF1α-DIO-NpHR3.0-eYFP
病毒滴度：＞1.0×1012 VG/mL
注射体积：1-1.5 μL
注射部位：大鼠中脑VTA区
注射方式：脑立体定位注射
操作方法：532 nm绿光激活NpHR3.0，强度16-18 mW，1.5s，4–20 kHz，间隔1 s，持续时间140s。
观察方式：免疫荧光、离体脑切片等。
图6. AAV介导eNpHR3.0-eYFP在VTA中TH阳性神经元中表达
以上便是一些常见光敏蛋白的应用，可见光遗传学不仅是调控神经元活动的有效方法，也可以运用到心脏等其他器官中，延申应用也有待进一步发展，并且是发表高质量文章的必备工具，大家若有相关方面的需求，欢迎与汉恒咨询联系~
参考文献：
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[2] Wang X, Cheng Y. Optical Manipulation of Perfused Mouse Heart Expressing Channelrhodopsin-2 in Rhythm Control. Methods Mol Biol. 2021;2191:377-390.
[3] Yizhar O, Fenno LE, Prigge M, Schneider F, Davidson TJ, O'Shea DJ, Sohal VS, Goshen I, Finkelstein J, Paz JT, Stehfest K, Fudim R, Ramakrishnan C, Huguenard JR, Hegemann P, Deisseroth K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 2011 Jul 27;477(7363):171-8.
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