中国湖泊中温度介导的微生物碳利用

文献信息

[题目]
Temperature-mediated microbial carbon utilization in China's lakes
中国湖泊中温度介导的微生物碳利用

[作者]
Yao Guo,Songsong Gu,Kaixuan Wu, Andrew J. Tanentzap,Junqi Yu,Xiangfen Liu, Qianzheng Li,Peng He,Dongru Qiu,Ye Deng,Pei Wang,Zhenbin Wu,Qiaohong Zhou

[期刊]
Global Change Biology（2022.12）
IF=11.6

摘要
微生物在水生碳循环中发挥着重要的作用，但对它们在大地理区域内对温度变化的功能反应了解有限。在这里，我们探索了微生物群落如何利用不同的碳基质，以及在未来气候变化的时空替代温度梯度下的潜在生态机制。该梯度包括来自中国五个主要湖区的47个湖泊，年平均气候MAT相差了 近乎15℃。我们的结果表明，与寒冷地区的湖泊相比，温暖湖群通常具有较低的碳浓度相关值和较高的碳利用率。在较高温度下，碳底物的利用率较高，这可能归因于细菌群落组成的变化，在较温暖的湖区，蓝细菌和放线菌（Cyanobacteria and Actinobacteriota）的丰度较高，变形菌（Proteobacteria）较少。还发现，微生物网络中的核心物种随着温度的升高而变化，从抑制氨基酸和碳水化合物利用的嗜氢菌科（Hydrogenophaga）和红细菌科（Rhodobacteraceae），到促进几乎所有碳底物利用的CL500-29-marine-group。总的来说，我们的发现表明，温度可以通过改变细菌和单个碳底物之间的相互作用来调节水生碳利用，影响碳利用的核心物种的发现提供了对未来气候变暖下内陆水体潜在碳封存的深入了解。

关键词
二分网络bipartite，湖泊，微生物碳利用，分子生态网络，温度

主要内容
（1）微生物在碳循环中发挥的功能复杂且多样，对不同的底物有不同的降解方式，其中微生物对于碳利用效率如何随温度的变化而变化仍不清楚。微生物对不同底物的差异性反应反映了其微生物群落的多样性和组成的差异。了解微生物群落与不同基质的关系对于预测它们在变暖温度下的代谢潜能至关重要。分子生态网络为识别微生物如何在广泛的环境中相互连接以及如何与不同的基质连接，并预测他们对未来变化的反应提供了方法。一般来说，尽管环境发生变化，稳定的相互作用网络可能会保持相互作用。网络分析还可以识别与其他群落成员密切相关的物种和基质，即核心物种。核心物种的改变可能会导致微生物代谢与基质联系的网络。然而，微生物群落的变化是否会影响大规模温度梯度下的网络稳定性和碳利用仍然是一个悬而未决的问题。本研究的主要目的是探索微生物群落在大规模温度梯度下如何影响它们在湖泊中的弹击之利用，并确定潜在的生态相互作用。作者收集了在夏季生长高温期中国五大湖区的47个湖泊，这些湖泊的温度梯度大到可成为未来气候变化的时空替代。我们将研究重点放在湖泊上，因为通过陆地碳补贴，细菌碳需求可以超过初级生产（Giorgio等人，1997；Tanentzap等人，2017），强调了淡水细菌对碳利用和转化的影响。本研究要解决的三个问题：沿空间温度梯度，湖泊中的细菌群落和碳利用有何不同？随着温度的升高，碳基质是如何被优先利用的？温度如何影响影响细菌和碳底物之间相互作用网络的稳定性？假设沿着温度梯度，微生物群落具有显著性差异，这将提高碳利用。

（2）五个湖区在气候条件、碳相关变量和营养相关变量方面存在差异。

根据ANOVA或Kruskal Wallis检验，所有其他30个环境变量在湖区之间也有所不同（图S1）。

根据PCA分析，年平均温度MAT是解释五个湖泊差异最重要变量。根据Pearson相关检验，PC1主要代表碳相关变量，PC2主要与营养相关变量有关，PC3主要与气候条件等变量相关

进行前两个变量的差异性分析（图2c、d）从最冷的湖泊区域到最热的湖泊区域两个变量呈相反的变化趋势，碳相关变量在五个湖区都存在显著性差异。MAT通常与碳相关指标呈负相关关系，与营养指标呈正相关，这表明气温升高可以减少碳相关变量（图2e）。

（3）湖区微生物群落组成与碳利用
基于稀疏rarefaction技术，鉴定了7748种细菌otu，并在不同湖区具有不同的丰度。中等寒冷的湖泊具有最高的α多样性（图s4）

        在分类学方面，在较冷的QTP湖中，变形菌Proteobacteria的丰度平均比在较温暖的EPR和YGP高56.5%和12.7%，而在EPR中，蓝细菌和放线菌（Cyanobacteria and Actinobacteriota）的丰度分别高79.8%和41.6%（p<.05）。 与EPR湖相比，中等寒冷的NCR湖中变形菌Proteobacteria的丰度平均高30.6%，蓝细菌和放线菌（Cyanobacteria and Actinobacteriota）的丰度分别比QTP湖高68.1%和67.9%（图3a；表S5）。细菌β多样性和温度之间的强负相关关系表明在β多样性较少的较高年平均温度下，湖泊的成分变得不那么相似（图3c），温度越高，β多样性的距离值越低，说明年平均温度高的湖泊相似度高，湖泊微生物群落组成差异小。
    基于群落多样性和组成的差异，发现五个湖区的微生物群落在碳利用方面也存在差异。NCR中度寒冷湖泊的微生物具有最大的碳利用率。其他地区湖泊的碳利用率大体相似，但微生物利用的特定碳底物存在差异。与较冷的MXP相比，中等寒冷的NCR和较温暖的YGP和EPR的微生物倾向于利用更多的氨基酸、羧酸和脂质（p<.05），而QTP和MXP的微生物利用更多的碳水化合物（图3f）。

     与碳和养分相关的变量解释了湖泊区域微生物碳利用的差异。具有较高营养相关变量值的湖泊微生物群落通常与单个碳基质的利用呈正相关（图4a）。同样，我们还发现来自碳相关白能量较低的湖泊微生物群落的个体利用率较高（图4a、s3）。单个底物的利用本身与MAT和养分浓度呈正相关。微生物碳利用的一些指标，如AWCD、碳利用的多样性和六个主要碳类别与温暖湖泊中丰富的门（蓝细菌和放线菌门）正相关，但与较冷湖泊中占主导地位的门（变形菌门）负相关，这证实了湖泊区域之间群落结构的变化（不同）可能是微生物碳利用差异的主要原因（图4b）。

（3）生物相互作用的分子生态网络 
为了确定五个湖区潜在的生物相互作用，我们构建了分子生态网络。网络指标表明拓扑是非随机的（表s7），因此可进一步分析。然而沿着整个温度梯度，很少有节点和边存在。一般来水，不到50%的节点和20%的链路在沿温度梯度的相邻湖区之间重叠

    第二个指标，脆弱性，也表明随着温度的升高，细菌网络变得更加脆弱和不稳定（图5e）。在最冷的湖区QTP和MXP，经验网络的脆弱性分别为0.05和0.06，在最热的湖区YGP和EPR分别增加到0.36和0.47。

（4）微生物与碳基质的二分网络
我们使用二分网络分析来描述微生物群落如何利用碳底物。正链接和负链接分别表示微生物可以促进或一直碳利用的效率（图6）。通过二分网络构建过程，在五个湖区的网络中总共鉴定出9-64种细菌和13-31种碳底物，观察到29-213个链接（图6；表S10）所有的二分网络包括羧酸、氨基酸、脂类和胺类碳节点以及放线菌、变形菌和蛭弧菌节点（表S11）。

在较冷的湖泊网络中表现出比较温暖湖区更多的负链，表明温暖的湖区比寒冷的湖区对微生物碳利用的抑制更大。（个人理解：碳利用和负相关关系均表示微生物与碳基质的消耗利用关系）。与温暖的湖区相比，在较冷湖泊中观察到潜在联系也较少，这进一步强调了更多的负联系。较冷湖区的网络通常偏向于细菌丰富度模式，而较暖湖区的网络偏向于碳利用模式，并且更多地嵌套在微生物群落旁边。

       随着温度的升高，从变形菌到放线菌的核心物种的缺失和替代导致微生物碳利用的显著变化，表明氨基酸、碳水化合物和羧酸利用的抑制促进了所有碳类别的利用。

个人小总结：每个部分的研究都相互验证相互成就，随着温度升高，微生物群落多样性降低，脆弱性增加，湖泊生态网络发生变化，故事讲的很好，基本就围绕一个问题在分析。

讨论
微生物碳利用受到许多环境因素的影响，这使得研究变得困难，但它对于预测全球变化情景下的碳循环至关重要。在这项研究中，我们发现细菌群落的组成和生态相互作用在跨越中国五个湖区几乎15涉事都温度梯度上发生的变化，最终改变了碳利用模式。这些发现扩展了之前对水生生态系统的研究，这些研究表明微生物群落对气候变暖相对敏感。通过证明其组成的变化将对碳底物的利用产生影响。
（1）温度升高使得细菌组成向更高的碳利用率转变
通过将微生物的丰度与他们在大规模温度梯度上对碳基质的利用联系起来，我们的研究表明，气候变暖将减少湖泊中的碳封存。结果表明，温度升高可以抑制变形菌的数量，但是促进蓝细菌和放线菌的数量，蓝细菌在没有受到温度限制时，会向淡水中释放生物可利用的脂质和氨基酸。因此，我们发现在较高的温度下，碳底物的利用增加并转向氨基酸、羧酸和脂质的利用。相反，在较冷湖泊中的微生物倾向于利用更多的碳水化合物，这可能在很大程度上是由于变形菌门Proteobacteria相对较高的丰度。变形菌的一些分类群在较低温度下保持高水平的酶活性，并且他们的细胞膜仍然保持高水平的酶活性，并且他们的细胞膜仍可渗透可用于生长和繁殖的长碳链（即复杂碳水化合物）。然而，在更高的温度下，变形菌从生长和繁殖转向产生热稳定的酶，从而允许碳水化合物积累。因此这些结果解释了为什么在温度较高的湖泊中具有较低的与谈浓度相关的变量值，尽管他们在潜在的地质上会有所不同，一般来说，随着温度的升高，胞外酶也会更加活跃，降解有有机碳的速度也会更快。同样，在较高的温度下，碳酸盐更有可能分解呈二氧化碳，其中CO2的可溶性较低，并进一步降低无机碳浓度。

（2）较高温度下较不稳定的微生物网络也会影响碳的利用
我们的发现表明，网络稳定性随着温度的升高而降低，这可能会使微生物对环境变化的抵抗力降低。这些发现通过网络稳定性与不同碳底物的利用直接联系起来，推进了先前描述气候变暖下微生物相互作用的研究。物种组成的更大变化，如在较低温度下观察到更高的β多样性，可以缓冲群落对环境变化的影响，提供增加群落稳定性的生态保险。降低群落组成可变性的变暖会降低微生物群落网络对额外变化的抵抗力，由于核心物种在分子生态网络中的中心位置，在决定微生物相互作用的强度以及网络稳定性方面发挥着特别重要的作用。在变暖等环境压力下，核心物种的变化会改变网络内大多数物种的相互作用，从而对生态稳定性产生不成比例的巨大影响。我们的结果确定变形菌是较冷湖泊的主要核心物种。随着气候变暖，这一群体逐渐减少并最终小时，降低了网络稳定性，改变了微生物碳利用模式。

（3）核心物种在改变微生物碳利用中的作用
我们发现分子生态网络中的核心物种在影响与其相连的碳底物方面起着特别重要的作用。变形菌门的嗜氢菌（OTU4856）和红细菌科（OTU1839）是寒冷湖区的优势核心种，在最温暖的湖区让位于酸杆菌门的CL500-29-marine group（OTU2664）。这种核心物种的转变会破坏微生物分类群之间的相互做要哪个，导致大量碳在较高温度下被积极利用，而不是被微生物被抑制。

结论
研究揭示了中国五个湖泊地区微生物群落对碳利用的温度梯度响应的生态学机制。我们发现，温暖地区的湖泊通常比寒冷地区的湖泊具有更低的碳相关变量值。这些模式与细菌群落结构和组成的变化有关。更重要的是，我们发现较高的年平均温度倾向于促进微生物对碳底物的利用，细菌和碳底物之间相互作用网络的核心物种从嗜氢菌科和红细菌科转变为CL500-29-海洋群。更一般地说，我们的研究表明，温度可以通过改变细菌和单个碳底物之间的相互作用来介导微生物的碳利用，并强调了微生物在更温暖的气候下减少碳隔离的机制。

研究方法
（1）研究区域和水取样
中国五大湖泊、具有15℃跨度的温度梯度的47个湖泊
 在每个湖泊中，我们在从海岸线到湖泊中心的3-5个位置收集了0.5-2.0米深度的未过滤地表水样本，并将其均质化为单个代表性样本（表S1）。然后将水在4°C下输送到实验室，并在12小时内进行处理。为了富集细菌群落，每个代表性水样（约2.0L）通过0.22μm玻璃微纤维膜过滤，滤膜储存在-80℃下，知道DNA提取。我们描述了每个湖泊的32个不同的地理、气候和湖沼学特征。其中包括用手持式全球定位系统（GPS）定位器（BHCnAV600）测量的纬度和经度，以及用多参数水质计（YSI公司）测量的pH值、水温（WT，°C）和盐度（SAL）。海拔（m）、气压（APK，kPa）、年平均气温（MAT，°C）、年最低气温（ATmin，°C）、年最高气温（ATmax，°C）和年平均降水量（AP，m）均由国家气象科学数据中心（http：//data.cma.cn/）获得。此外，根据国家环保局（1994）的规定，采用酸滴定法测定天然水体中的总碱度（TA）。使用测量的TA，我们获得碳酸氢盐（分别为CH和AH）和碳酸盐（分别为CC和AC）的浓度和碱度，以及溶解无机碳（DIC）的浓度（Denny等人，1983）。对于溶解有机碳（DOC）浓度，约10毫升水通过0.7μm孔径的玻璃微纤维膜（GF/F过滤器，Whatman，GE Healthcare Life Sciences）过滤，并在用1 mol/L HCl酸化至pH<3.0后在总有机碳分析仪（vario TOC select，Elementar）上测量。其他营养元素测定通过比色法测定。采用钼酸铵分光光度法测定无机磷(IP)浓度，不经过硫酸钾消化，由TP和IP之差计算有机磷(OP)浓度。最后，将500毫升水直接通过1.2μm孔径的玻璃微纤维膜（GF/C过滤器，Whatman，GE Healthcare Life Sciences）过滤，在提取90%丙酮并在-20°C下储存48小时后，使用分光光度法测定每个湖中的叶绿素a浓度。我们还计算了一些变量（DOC/TN、DIC/TN、TN/TP、TA/SAL、AP/MAT和海拔/APK）的比值，以进一步表征湖泊的营养状况。

（2）DNA提取、扩增子测序与生物信息学

DNA提取试剂盒。16S rRNA基因的V3-V4高变区用引物对338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-G G A C T A C HV G GG T WT C T M A T-3′）用ABI GeneAmp®9700 PCR热循环仪（ABI）扩增。20 μL PCR混合物包含6.4 μl FastPfu聚合酶主混合物（转基因），0.8 μL正向和反向引物以及10 ng样本DNA。然后使用一步PCR方案扩增16S rRNA基因，最初在95℃变性3分钟，然后在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸45秒，最后在72℃单次延伸10分钟每个样品产生三份PCR产物，并根据制造商的说明使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axxygen Biosciences）纯化，并使用QuantusTM荧光计（Promega）定量。在Majorbio Bio-Pharm Technology Co.Ltd。的Illumina MiSeq平台（Illumina）上以等摩尔浓度汇集纯化的扩增子并对配对末端（2×300 bp）进行测序。在修剪条形码和引物后，使用标准方法处理原始读数。使用fastp v0.20.0立即丢弃50 bp滑动窗口内平均质量分数≤20、短于50 bp或N碱基不明确的读数（Chen等人，2018）。然后使用FLASH v1.2.7合并重叠≥10 bp且错配≤0.2的正向和反向读数（Magoc&Salzberg，2011）。使用UPARSE v7.1通过UCLUST以97%的相似性水平对操作分类单位（otu）进行聚类（Edgar，2013；Stackebrandt&Goebel，1994年）。然后使用分类器v2.2（Wang等人，2007年）和SILVA v138.1数据库的默认设置对otu进行分类分配，置信截止值为0.7。所有样本都被重新采样到最小观察深度（25，538个读数），用于随后的群落分析（图S2）。

（3）微生物群落碳利用情况
Biolog EcoPlates
我们使用Biolog生态板。稀释水悬浮液用于接种微孔板中的孔，制备如下。首先，将5毫升未过滤的水转移到装有45毫升0.89%无菌盐水的锥形烧瓶中，以保持稳定的渗透压，混合并均质。以每孔150 μL的浓度，将匀浆的上清液直接注射到平板中。将平板在黑暗和25℃下孵育10天。每隔24小时，用平板阅读器（SpectraMax i3X，分子设备公司）进行590和750纳米的光密度（OD）测量。590 nm处的测量是专门设计来捕获微生物利用底物引起的生态板中使用的染料的变化，750 nm处的吸光度用作校准这些结果的对照。根据31种不同碳底物上的平均孔颜色显影（AWCD）来估计微生物碳利用效率，因为其中Ci是每个孔i的OD590和OD750之间的差，R是对照孔的吸光度值，n是碳底物的总数（n=31）。较高的AWCD表明微生物碳利用的潜力较大。所有31种碳底物被进一步分为六大类，碳水化合物、氨基酸、羧酸、胺、脂类和醇，将每一类碳底物的利用率称为碳利用率（表S2）。最后，我们计算了31个不同Ci值中每一个的碳利用多样性，以反映微生物群落碳利用的可变性。我们使用麦金托什多样性指数进行这些计算，因为它旨在捕捉物种数量相似的群落中的差异。其他碳利用多样性指数代表活动率。

（4）数据分析
首先，我们使用主成分分析（PCA）确定了五个湖区内47个湖泊的差异。

我们将气候条件（纬度、经度、海拔、APK、MAT、ATmin、ATmax、AP、AP/MAT、海拔/APK）、碳相关变量（pH、SAL、TA、AH、CH、AC、CC、DIC、DOC/TN、DIC/TN、TA/SAL）和营养相关变量（WT、DOC、TN、NO3-N、N O 2-N、N H 3-N、Chl-a、TP、IP、OP、TN/TP）输入PCA，并使用皮尔逊相关性测试这32个变量中的每一个与PCA的前三个轴中的每一个之间的关联。然后，我们对用欧几里德距离计算的（不）相似性矩阵（MRM）进行多元回归，以确定最能解释湖泊间差异的环境特征。

我们使用Spearman等级相关分析将MRM试验确定的重要变量与微生物组成和碳利用的差异相关联。在运行PCA和MRM之前，每个原始环境变量的平均值为零，标准偏差为1。

其次，如果数据即使在Box-Cox、对数或平方根变换后也不是正态分布，我们使用单向方差分析或Kruskal-Wallis检验来测试湖泊区域之间在水化学、细菌群落的组成（门水平）和α多样性（丰富度）以及微生物碳利用方面的差异。

用Fisher最小显著差异检验进一步确定组均值的统计学显著差异。

用Jaccard距离计算湖泊间的微生物β多样性，并通过主坐标分析（PCoA）可视化。

然后，我们使用线性回归来测试β多样性（Jaccard相异距离）如何随年平均温度（欧几里德相异距离）变化。

使用排列检验对成对比较的非独立性对p值进行校正。

我们将vegan v2.5-7（Oksanen等人，2020年）软件包用于PCoA和PCA，将geosphere v1.5-14（Hijmans，2021年）软件包用于MRM，将psych v2.2.5软件包（Revelle，2022年）用于Spearman等级相关性。