合作文章 | 青莲百奥血浆深度挖掘策略突破神经系统疾病研究障碍
血浆样本在临床上易于获取并且生物信息丰富，因此血浆蛋白质组学研究受到广泛关注。然而，血浆中的一些高丰度蛋白质占据大量的质谱信号从而使得低丰度蛋白质不容易被质谱检测到。神经系统疾病的组织取样困难，血浆或脑脊液等体液样本都受到信号抑制的影响，导致神经系统疾病的研究尤为困难。
近日，青莲百奥CTO赵焱博士与中国人民解放军总医院李芮冰主任团队合作的血浆蛋白质组最新成果“基于纳米材料蛋白冠血浆蛋白质组学深度挖掘策略的建立及临床应用评价”见刊《Analytica Chimica Acta》（IF=6.2）。该研究结合青莲百奥自主研发的纳米材料蛋白冠富集血浆蛋白技术（MagicOmics-DMB）、蛋白质组学全流程自动化前处理机器人（MagicOmics-AP-96），并优化DIA-MS检测方法以及DIA-NN文库检索方法，青莲百奥团队开发了血浆蛋白质组学深度挖掘策略的范式，并将该策略应用于精准医疗诊疗标志物的创新发现。
研究思路
该研究建立了血浆蛋白质组深度挖掘策略：利用DMB磁珠富集低丰度蛋白质，采用DIA扫描方法获得全息质谱，对数据进行DIA-NN处理，得到定性和定量结果。
随后设计了一系列实验来评估该策略的有效性：
DMB磁珠富集与传统富集方法的定性深度和重现性比较：高丰度蛋白去除（2种和14种）、六肽配体富集和DMB磁珠富集处理，比较定量结果
血浆和DMB磁珠不同孵育时间和消化方法的比较：不同时间（0.5、1、2和4小时）孵育，比较定量结果
不同血浆加入体积富集结果比较：不同体积的血浆样品加入等体积的DMB磁珠中进行富集，比较定量结果
定量结果可靠性评价：向等量的血浆中添加不同梯度的大肠杆菌蛋白混合物，检测大肠杆菌蛋白和血浆蛋白
最后采用该策略分析了来自MSA组和健康对照组（MSA患者n=18；健康对照n = 18）的血浆样本。
研究结果
一、蛋白鉴定深度和重复性评估
将来自同一志愿者的血浆样本分为四部分，分别进行高丰度蛋白去除（2种和14种）、六肽配体富集和DMB磁珠富集处理。比较发现，DMB磁珠法显著增加了血浆蛋白的鉴定数量，其中特有的鉴定蛋白数量达到1031个。特有蛋白的KEGG通路分析表明许多蛋白质参与了脑疾病相关通路，包括阿尔茨海默病、帕金森病和神经元生成通路，这为脑疾病的研究提供了更多的分析指标。DMB磁珠对不同丰度血浆蛋白的富集能力远超过其他处理方法，在μg/L和ng/L浓度范围内的蛋白质上表现出色。而且，DMB磁珠能富集浓度相比其他方法可检测更低数量级的蛋白。
选择3名不同健康志愿者（2女1男）的血浆样本用DMB磁珠富集后进行质谱分析（3次重复），发现共同鉴定蛋白占每个样本总蛋白数量的83%以上。同一样本的3次重复中，CV<20%的蛋白占所有蛋白的87%以上。个体间差异所占蛋白质的比例不超过总蛋白的59%。
二、不同孵育时间和酶解方法的比较
不同的孵育时间（0.5、1、2和4小时）下获得的定量结果具有良好的相关性（r>0.9），而增加孵育时间并不会增加鉴定蛋白质的数量。与传统的酶解方法相比，DMB磁珠法可以直接在珠子上进行酶解，有效地减少了蛋白质的损失并增加了蛋白质的鉴定数量同时可以节省洗脱和转移管的时间，可以更高效完成大队列临床样本处理。
三、不同体积的血浆富集结果评估
将不同体积的血浆样品加入等体积的DMB磁珠中进行富集，观察富集到蛋白质的丰度变化。所有结合蛋白的MS总峰面积随着血浆体积的增加而逐渐增加，在血浆加入体积为1μl时达到平稳，表明磁珠的结合位点开始饱和。随着血浆添加量的不断增加，具有高亲和力的蛋白逐渐代替之前结合的亲和力低但丰度高的蛋白，实现了低和中丰度蛋白的富集。当血浆体积达到50μl后，蛋白质的数量增加减慢。
磁珠富集蛋白的质谱检测强度与血浆添加体积之间呈线性相关。与mg/L水平的蛋白相比，相关系数为1.0的蛋白数量较高，且浓度在μg/L和ng/L的蛋白显示出更好的相关性。
从高丰度低亲和力的蛋白质和低丰度高亲和力的蛋白质中各选取50种蛋白质分析长度、分子量、疏水性、等电点、脂溶指数和氨基酸数量等方面的差异，结果显示亲和力、等电点以及色氨酸和半胱氨酸残基的数量主导了DMB磁珠的蛋白冠组成。STRING分析显示两类蛋白可以形成不同的网络群，表明蛋白冠的形成与蛋白质的相互作用密切相关。当高亲和力蛋白被富集时，与这些蛋白有密切相互作用的蛋白也可以被同时富集。
四、低丰度蛋白定量结果的可靠性
向等量的血浆中添加不同梯度的大肠杆菌蛋白混合物，检测大肠杆菌蛋白定量和血浆蛋白的变化，结果显示血浆蛋白比值变化范围在0.94-1.25中显示出较小的波动，而大肠杆菌蛋白在比值上呈梯度变化，表明磁性材料的富集与样品中蛋白质的丰度有关，而不是完全无序的富集状态。通过DMB磁珠富集，可以实现对血浆样本中低丰度蛋白质的定量比较。
五、深度挖掘策略在MSA中的应用
与没有富集相比，富集后每个样品鉴定的蛋白质数量增加了3倍以上。差异表达蛋白将MSA组与健康对照组区分开。上调蛋白主要与蛋白磷酸化、抗菌肽和肽酶活性以及免疫应答等相关。下调蛋白与肌动蛋白和血脑屏障功能的维护有关，这与疾病的表型特征相一致。免疫和脑疾病相关差异蛋白在血浆中浓度很低，通常只能通过脑脊液检测到，现在可以通过磁性材料的富集技术来检测和定量。对与神经系统疾病相关或在脑组织中特异性表达的关键蛋白ENPP2、BNDF和SLC2A1/Glut1的ELISA验证结果与质谱结果一致。
研究总结
该研究的血浆深度挖掘策略提高了血浆蛋白质组的检测深度，同时在样品富集方面具有良好的稳定性，同时在节省时间和减少损失方面具有一定优势。将该策略应用于MSA疾病标志物发现中，鉴定出18种与神经系统疾病相关或脑组织特异性表达的差异蛋白，并交叉验证了ENPP2和SLC2A1/Glut1蛋白的ELISA结果，证明了临床生物标志物研究的可行性。
