脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA—脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体。其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录表达。

Lipo2000是最常见的广谱脂质体转染试剂，以其操作简单、转染效率高、对细胞毒性较低等优点，在各大高校实验室、研究所等都得到广泛的使用。下面将以24孔板对应用量为例，简单介绍DNA转染哺乳动物细胞的操作方法。

1. 实验用品

1.1 主要试剂：

Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent （Invitrogen 11668019）

Opti-MEM® I Reduced Serum Medium（Gibco 31985-062）

1.2 主要耗材：
无菌枪头，一次性移液管，1.5mL EP管，15 mL离心管，细胞计数板，24孔板

2.实验操作

2.1 细胞准备

1) 贴壁细胞：转染前一天，在500μL无抗生素的培养基中接种细胞，约0.5-2×105个/孔。

2) 悬浮细胞：转染前一天，在500μL无抗生素的培养基中接种细胞，约4-8×105个/孔。

2.2 DNA—脂复合体配制

1) 准备两支1.5mL EP管（标记管1和管2），加入50μL Opti-MEM® I 低血清培养基（如无，可使用其他无血清培养基代替）。

2) 取1 μg目的质粒（DNA），加入管1稀释，轻轻混匀。

3) 充分吹打混匀Lipofectamine™ 2000原液管，按照DNA（μg）与Lipo（μL）添加比例1:2-1:3，取2-3μL Lipo悬液加入管2稀释混匀，室温下静置5min。

4) 将管1与管2合为一管，体积为100μL，充分混合，室温下静置20min。

5) 小心吸取管内的100μL复合体，缓慢滴加入待转染的孔内（此时孔内细胞汇合度或细胞密度约在90%以上），轻轻摇匀并放置培养箱培养。

2.3 细胞观察及终止转染

1) 培养4-6h后，观察细胞状态，并更换新鲜培养基，放置培养箱中继续培养。如贴壁细胞变圆漂浮，换液时则需收集上清中的细胞，离心后将细胞沉淀接种回孔内。

备注：如细胞属于较难转染的类型，可适当延长细胞转染时间，不超过24h。

2) 24-48h后可观察细胞状态及转染效率，并根据具体实验要求进行后续药筛等工作。

作者：海星生物

公众号：Cas9X细胞基因编辑

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