质粒小提、中提、大提实验
1 前言说明
本课题组质粒提取主要使用的是大肠杆菌转化细胞（DH5α），其质粒转化实验主要依据产品说明书。
而质粒小提、中提、大提主要是提取量的差异，由于量的差异导致操作有些许不同，本实验方案是收纳及归纳个人在实验过程中的执行方案。
2 质粒小提
2.1实验设备及材料信息
2.1.1 试剂盒信息
QIAGEN Plasmid Midi Kit（12143）
2.1.2 离心机信息
型号：Eppendorf 5424R
适合离心管：1.5ml/2.0ml
最大转速：21130g/15000rpm
2.1.3 分光光度计信息
型号：NANO-ONE
序列号：YN-N01-026
输入电压：DC12V
生产公司：杭州佑宁仪器有限公司
2.2实验操作程序
1.取2ml菌液至2ml离心管中，离心：8000g-2min-25℃，结束后弃上清
2.沉淀中加入250ul P1 buffer（从冰箱中取用，注意是否已加(RNase I and blue），并吹打至重悬混匀（吹打应当轻缓）
3.加入250ul P2 buffer，立即温和颠倒混匀5-10次（溶液呈蓝色），充分混匀，室温静置2min
4.加入350ul P3 buffer，立即温和颠倒混匀5-10次（溶液蓝色消失），静置2min
5.离心：20000g（最大转速）-10min-25℃，结束后将上清转移至吸附柱
6.离心：9000g（最大转速）-30sec-25℃，弃掉收集管中的液体
7.在柱中加入500ul DW1（去蛋白），离心：9000g（最大转速）-30sec-25℃，弃掉收集管中的液体
8.加入500ul Wash Solution，离心：9000g（最大转速）-30sec-25℃，弃掉收集管中的液体（重复2次）
9.将空吸附柱再次离心，离心：9000g（最大转速）-60sec-25℃
10.将吸附柱转移至新的离心管中，在吸附柱膜中央加入30ul ddH2O,静置3-5min，之后离心：9000g（最大转速）-60s-25℃
11.使用分光光度计检测小提浓度并做好记录，例：质粒完整名称-浓度（ng/ul）-提取时间-操作者
3 质粒中提
3.1实验设备及材料信息
3.1.1试剂盒信息
QIAGEN Plasmid Mini Kit (12125)
3.1.2 离心机信息
型号：Eppendorf 5430R
序列号：5428EL5243
适合离心管：15ml/50ml
最大转速：7197g
3.1.3 分光光度计信息
型号：NANO-ONE
序列号：YN-N01-026
输入电压：DC12V
生产公司：杭州佑宁仪器有限公司
3.2实验操作程序
1.经过大摇（培养基50ml）培养12-16h的细菌，转移至50ml的离心管中
2.离心：4℃，6000g，15min
3.离心后，弃掉培养基，加4ml P1 Buffer (注意是否已加RNase I and blue,4℃储存）重悬（温和吹打，充分混匀）
4.开始加入4ml P2 Buffer（裂解液），静置5min（时间要求精准），上下混匀或者摇匀10次（P1有显色剂，加入P2后，则溶液变蓝）
5.时间到后， 立即加入4ml P3 Buffer，停止裂解，上下混匀或者摇匀直至蓝色消失，埋入冰中，静置15min。
6.时间到后，离心：4℃，7197g（离心机最大转速），60min
7.离心结束后，取出，用擦手纸充当滤纸进行过滤，转移至另一个50ml离心管（注意从沉淀侧对侧倾倒液体）
8.与此同时，将吸附柱放在50ml离心管上，加4ml QBT过柱子（待用）
9.步骤7过滤后的上清液转移至吸附柱（收集废液离心管可以用旧的，减少浪费）
10.当吸附柱无液体流出后，加入20ml QC Buffer（分两次，每次加10ml)，与此同时，将QF Buffer放入烘箱预热50℃
11.取15ml 离心管，用封口膜和吸附柱缠在一起（扎几个孔），向吸附柱加入5ml QF Buffer
12.当吸附柱无液体流出后，拆开封口膜，在离心管中加入3.5ml 异丙醇（观察到灰白色液体层，上下颠倒混匀，后离心，异丙醇的作用是沉淀DNA）
13.离心管离心：4℃，7000g，60min,弃上清（会观察管底侧有白色斑点，即DNA沉淀）
14.向离心管中加入70% 乙醇 2ml（从冰箱里拿），4℃，7000g，30min
15.步骤14弃掉上清后，打开盖子，待乙醇挥发干净，加入100ul ddH2O，进行溶解（放入烤箱10min）
16.使用分光光度计测浓度，先用溶解DNA的稀释液ddH2O作为空白对照，后吸取提取产物1ul 测定浓度并记录，例：质粒完整名称-浓度（ng/ul）-提取时间-操作者
4 质粒大提
4.1实验设备及材料信息
4.1.1试剂盒信息
The EndoFree Plasmid Maxi Kit (cat. no. 12362)-QIAGEN
4.1.2 离心机信息
型号：Eppendorf 5430R
序列号：5428EL5243
适合离心管：15ml/50ml
最大转速：7197g
4.1.3 超微量分光光度计信息
型号：NANO-ONE
序列号：YN-N01-026
输入电压：DC12V
生产公司：杭州佑宁仪器有限公司
4.2实验操作程序
1.将摇菌200ml的菌液（12-16h）分装转移至50ml离心管中（管壁，盖子做好标记）
2.离心：4℃，6000g，15min（注意配平问题）
3.离心后，弃掉培养基，加10 ml P1 Buffer (注意是否已加RNase I and blue, 4℃储存）重悬（移液枪吹打，少许振荡混匀也行）
4.开始加入10 ml P2 Buffer（裂解液），静置5min（时间要求精准），上下混匀或者摇匀10次（P1有显色剂，加入P2后，则溶液变蓝）
5.时间到后， 立即加入4ml P3 Buffer，停止裂解，上下混匀或者摇匀直至蓝色消失
6.组装过滤管（底部盖子旋拧过滤管）（此时推塞不要安装）
7.将步骤5所获全部转移至过滤管（两管倾斜30°左右转移，注意不要洒出），静置10min
8.此时，准备4只50ml离心管备用（管壁，盖子做好标记），待步骤7静置结束后，旋开底部盖子，上部安装推塞，将液体转移至准备OK的离心管中。
9.于步骤8过滤液体中加入2.5ml的Buffer ER（去除内毒素），于冰上静置30min
10. 与此同时，将吸附柱放在50ml离心管上，加4ml QBT过柱子（待用）
11.将过滤液体缓慢倾倒在吸附柱
12.当吸附柱无液体流出后，加入60ml QC Buffer（分两次，每次加30ml)
13. 将向吸附柱转移至新的50ml离心管中，并向吸附柱中加加入15ml QN Buffer洗脱DNA
14.弃掉吸附柱，向洗脱后的液体中加入10.5ml 异丙醇（0.7倍洗脱所得液体体积）
15. 离心：4℃，7197g，60min，弃上清（注意配平问题）（会观察管底侧有白色斑点，即DNA沉淀）
16.向离心管中加入70% 乙醇 5ml（从冰箱里拿），4℃，7197g，30min，弃上清（注意不要弃掉沉淀DNA，可能会漂浮）
17.打开盖子，待乙醇挥发干净，加入200-500ul ddH2O，进行溶解（溶解液体视沉淀DNA大小而定）
18.使用分光光度计测浓度，先用溶解DNA的稀释液ddH2O作为空白对照，后吸取提取产物1ul 测定浓度并记录，例：质粒完整名称-浓度（ng/ul）-提取时间-操作者
