生物化学知识点及习题解析---第九章 核酸的生物合成

第九章  核酸的生物合成

 

一、知识要点

 

在细胞分裂过程中通过DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发育过程中遗传信息由DNA传递到RNA，最后翻译成特异的蛋白质；在RNA病毒中RNA具有自我复制的能力，并同时作为mRNA，指导病毒蛋白质的生物合成；在致癌RNA病毒中，RNA还以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。这种遗传信息的流向称为中心法则。

复制是指以原来DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程；转录是在DNA（或RNA）分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA（或DNA）的过程；翻译是在以rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体上，以mRNA为模板，根据每三个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由tRNA运送氨基酸，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。

（一）  DNA的生物合成

在DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先行解旋和分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链，这样从亲代DNA的分子可以精确地复制成2个子代DNA分子。每个子代DNA分子中，有一条链是从亲代DNA来的，另一条则是新形成的，这叫做半保留复制。通过14N和15N标记大肠杆菌实验证实了半保留复制。

1．复制的起始点与方向

DNA分子复制时，在亲代分子一个特定区域内双链打开，随之以两股链为模板复制生成两个子代DNA双链分子。开始时复制起始点呈现一叉形（或Y形），称之为复制叉。DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此特定部位称为复制起始点（origin of replication），可以用ori表示。在原核生物中复制起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有一个起始点。真核生物的染色体是在几个特定部位上进行DNA复制的，有几个复制起始点的。酵母基因组与真核生物基因组相同，具有多个复制起始点。

复制的方向可以有三种不同的机制。其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方向生长出一条新链，形成两个复制叉。其二是从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。其三是从一个起始点开始，沿两个相反的方向各生长出两条链，形成两个复制叉。

2．DNA聚合反应有关的酶及相关蛋白因子

DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了需要酶的催化之外，还需要适量的DNA为模板，RNA（或DNA）为引物和镁离子的参与。催化这个反应的酶也有多种：DNA聚合酶、RNA引物合成酶（即引发酶）、DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因子参与。

3．DNA的复制过程

DNA的复制按一定的规律进行，双螺旋的DNA是边解开边合成新链的。复制从特定位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。由于DNA双链的合成延伸均为5′→3′的方向，因此复制是以半不连续的方式进行，即其中一条链相对地连续合成，称之为领头链，另一条链的合成是不连续的，称为随后链。在DNA复制叉上进行的基本活动包括双链的解开；RNA引物的合成；DNA链的延长；切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段。

（二）逆向转录

在逆转录酶作用下，以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆向转录。逆转录酶需要以RNA（或DNA）为模板，以四种dNTP为原料，要求短链RNA（或DNA）作为引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子Mg2+和Mn2+，沿5′→3′方向合成DNA，形成RNA-DNA杂交分子（或DNA双链分子）。逆转录酶是一种多功能酶，它除了具有以RNA为模板的DNA聚合酶和以DNA为模板的DNA聚合酶活性外还兼有RNaseH、DNA内切酶、DNA拓扑异构酶、DNA解链酶和tRNA结合的活性。

几乎所有真核生物的mRNA分子的3′末端都有一段多聚腺苷酸。当加入寡聚dT作引物时，mRNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。

（三）DNA突变

DNA突变  是指DNA的碱基顺序发生突然而永久性地变化，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着改变，表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有几种形式：（1）一个或几个碱基对被置换；（2）插入一个或几个碱基对；（3）一个或多个碱基对缺失。置换和插入的变化是可逆的，缺失则是不可逆的。最常见的突变形式是碱基对的置换。嘌呤碱之间或嘧啶碱之间的置换称为转换，嘌呤和嘧啶之间的置换称为颠换。突变有自发突变和诱发突变。在DNA的合成中，自发突变的机率很低，大约每109个碱基对发生一次突变；各种RNA肿瘤病毒具有很高的自发突变频率。诱发突变可以由物理因素或化学因素引起，物理因素如电离辐射和紫外光等均可以诱发突变。化学因素的诱变，如脱氨剂和烷化试剂均可诱发突变。亚硝酸为强脱氨剂，可使腺嘌呤转变为次黄嘌呤，鸟嘌呤转变为黄嘌呤，胞嘧啶转变为尿嘧啶，而导致碱基配对错误。烷化剂如硫酸二甲酯（DMS）可使鸟嘌呤的N7位氮原子甲基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团，减弱N9位上的N-糖苷键，至使脱氧核糖苷键不稳定，发生水解而丢失嘌呤碱，以后可被其它碱基取代，或引起DNA的链断裂。

（四）DNA损伤与修复

某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能引起生物突变和致死。因为它们均能作用于DNA，造成其结构和功能的破坏。但细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上的损伤，恢复DNA的正常双螺旋结构。目前已经知道有四种修复系统：光复活，切除修复，重组修复和诱导修复。后三种机制不需要光照，因此又称为暗修复。

1．光复活

光复活的机制是可见光（最有效波长为400nm左右）激活了光复活酶，它能分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。光复活作用是一种高度专一的修复方式。

2．切除修复

又称为复制前修复。所谓切除修复，即是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。这是比较普遍的一种修复机制，它对多种损伤均能起修复作用。参与切除修复的酶主要有：特异的核酸内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶。

3．重组修复

遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从完整的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。此过程称为重组修复，因为发生在复制之后，又称为复制后修复。

参与重组修复的酶系统包括与重组有关的主要酶类以及修复合成的酶类。重组基因rec A编码的蛋白质，具有交换DNA链的活力。rec A蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起着关键的作用。rec B和rec C基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基，该酶亦为重组和重组修复所必需。修复合成时需要DNA聚合酶和连接酶。

4．诱导修复

许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。SOS反应包括诱导出现的DNA损伤修复效应、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等等。

（五）RNA的生物合成

以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，以四种核糖核苷磷酸为底物按照碱基配对原则，形成3′→5′磷酸二酯键，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。RNA的转录起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点处终止。在生物体内，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，这称为转录的不对称性。用作模板的链称为反义链，另一条链称为有义链，因为有义链的脱氧核苷酸序列正好与转录出的RNA的核苷酸序列相同（只是T与U的区别），所以也称编码链。但各个基因的有义链不一定位于同一条DNA链。RNA的合成沿5′→3′方向进行（DNA模板链方向为3′→5′），5′未端为核糖核苷三磷酸，即5′位保留PPP。

在真核生物细胞里，转录是在细胞核内进行的。合成的RNA包括mRNA、rRNA和tRNA的前体。rRNA的合成发生在核仁内，而合成mRNA和tRNA的酶则定位在核质中。另外叶绿体和线粒体也进行转录。原核细胞中转录酶类存在于细胞液中。

1．RNA聚合酶

原核细胞大肠杆菌的RNA聚合酶研究的较深入。这个酶的全酶由5种亚基（α2ββ′δω）组成，还含有2个Zn原子。在RNA合成起始之后，δ因子便与全酶分离。不含δ因子的酶仍有催化活性，称为核心酶。δ亚基具有与启动子结合的功能，β亚基催化效率很低，而且可以利用别的DNA的任何部位作模板合成RNA。加入δ因子后，则具有了选择起始部位的作用，δ因子可能与核心酶结合，改变其构象，从而使它能特异地识别DNA模板链上的起始信号。

真核细胞的细胞核内有RNA聚合酶I、II和III，通常由4～6种亚基组成，并含有Zn2+。RNA聚合酶I存在于核仁中，主要催化rRNA前体的转录。RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ存在于核质中，分别催化mRNA前体和小分子量RNA的转录。此外线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶，其特性类似原核细胞的RNA聚合酶。

2．RNA的转录过程

RNA转录过程为起始位点的识别、起始、延伸、终止。

起始位点的识别：RNA聚合酶先与DNA模板上的特殊启动子部位结合，σ因子起着识别DNA分子上的起始信号的作用。在σ亚基作用下帮助全酶迅速找到启动子，并与之结合生成较松弛的封闭型启动子复合物。这时酶与DNA外部结合，识别部位大约在启动子的-35位点处。接着是DNA构象改变活化，得到开放型的启动子复合物，此时酶与启动子紧密结合，在-10位点处解开DNA双链，识别其中的模板链。由于该部位富含A-T碱基对，故有利于DNA解链。开放型复合物一旦形成，DNA就继续解链，酶移动到起始位点。

3．起始：在起始位点的全酶结合第一个核苷三磷酸。第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷酸掺入的位置称为转录起始点。这时σ亚基被释放脱离核心酶。

4．延伸：从起始到延伸的转变过程，包括σ因子由缔合向解离的转变。DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA的结合松弛，核心酶可沿模板移动，并按模板序列选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3′-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向是沿DNA模板链的3′→5′方向按碱基酸对原则生成5′→3′的RNA产物。RNA链延伸时，RNA聚合酶继续解开一段DNA双链，长度约17个碱基对，使模板链暴露出来。新合成的RNA链与模板形成RNA-DNA的杂交区，当新生的RNA链离开模板DNA后，两条DNA链则重新形成双股螺旋结构。

4．终止  在DNA分子上有终止转录的特殊碱基顺序称为终止子（terminators），它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和释放RNA链的作用。这些终止信号有的能被RNA聚合酶自身识别，而有的则需要有ρ因子的帮助。ρ因子是一个四聚体蛋白质，它能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分。它的作用是阻RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。对于不依赖于ρ因子的终止子序列的分析，发现有两个明显的特征：即在DNA上有一个15～20个核苷酸的二重对称区，位于RNA链结束之前，形成富含G-C的发夹结构。接着有一串大约6个A的碱基序列它们转录的RNA链的末端为一连串的U。寡聚U可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。在真核细胞内，RNA的合成要比原核细胞中的复杂得多。

（六）转录后加工

在转录中新合成的RNA往往是较大的前体分子，需要经过进一步的加工修饰，才转变为具有生物学活性的、成熟的RNA分子，这一过程称为转录后加工。主要包括剪接、剪切和化学修饰。

1．mRNA的加工  在原核生物中转录翻译相随进行，多基因的mRNA生成后，绝大部分直接作为模板去翻译各个基因所编码的蛋白质，不再需要加工。但真核生物里转录和翻译的时间和空间都不相同，mRNA的合成是在细胞核内，而蛋白质的翻译是在胞质中进行，而且许多真核生物的基因是不连续的。不连续基因中的插入序列，称为内含子；被内含子隔开的基因序列称为外显子。一个基因的外显子和内含子都转录在一条很大的原初转录本RNA分子中,故称为核内不均一RNA（hnRNA）。它们首先降解为分子较小的RNA，再经其它修饰转化为mRNA。真核细胞mRNA的加工包括：（1）hnRNA被剪接，除去由内含子转录来的序列，将外显子的转录序列连接起来。（2）在3′末端连接上一段约有20～200个腺苷酸的多聚腺苷酸（poly A）的“尾巴”结构。不同mRNA的长度有很大差异。（3）在5′末端连接上一个“帽子”结构m7GpppmNP。（4）在内部少数腺苷酸的腺嘌呤6位氨基发生甲基化（m6A）.

2．tRNA的加工  原核生物的tRNA基因的转录单元大多数是多基因的。不但相同或不同的tRNA的几个基因可转录在一条RNA中，有的tRNA还与rRNA组成转录单元，因此tRNA前体的加工过程包括剪切、剪接，在3′-末端添加CCAOH、以及核苷酸修饰转化为成熟的tRNA。tRNA中含有许多稀有碱基，所有这些碱基均是在转录后由四种常见碱基经修饰酶催化，发生脱氨、甲基化、羟基化等化学修饰而生成的。

3．rRNA的加工  原核细胞首先生成的是30S前体rRNA，经核糖核酸酶作用，逐步裂解为16S、23S和5S的rRNA，其裂解过程可归纳如下：

原核生物16S rRNA和23S rRNA含有较多的甲基化修饰成分，特别是2-甲基核糖。一般5S rRNA中无修饰成分。在真核细胞中rRNA的转录后加工与原核细胞类似，但更为复杂。rRNA在核仁中合成，生成一个更大35～45S前体rRNA。前体分裂而转变为28S、18S和5.8S的rRNA分子。真核生物5S rRNA前体是由独立于上述三种rRNA之外的基因转录的。真核生物rRNA中与含有较多的甲基化成分。

有关RNA剪接、剪切机制的研究不仅发现了RNA分子本身具有催化功能，这种具有剪接功能的RNA催化剂命名为核酶。目前已发现的具有催化功能的RNA有磷酸二酯酶（核糖核酸酶）、磷酸单酯酶、核苷酸转移酶、磷酸转移酶、RNA限制性内切酶、 tRNA 5′端成熟酶、α-1,4-葡聚糖分支酶和肽基转移酶等。目前研究表明核酶催化rRNA、tRNA、mRNA的剪接机理是不相同的。RNA内含子有四种类型，即Ⅰ型自我拼接内含子、Ⅱ型自我拼接内含子、核mRNA内含子和核tRNA内含子。

（七）RNA的复制

大多数生物的遗传信息贮藏的DNA中，遗传信息按中心法则由DNA 转录成RNA， 再由RNA翻译成蛋白质的。对RNA病毒的研究表明，某些RNA病毒是以RNA作模板复制出病毒RNA分子。

Qβ噬菌体RNA的复制可分为两个阶段：（1）当Qβ噬菌体侵染大肠杆菌细胞后，其单链RNA充当mRNA，利用宿主细胞中的核糖体合成噬菌体外壳蛋白质和复制酶β亚基；（2）当复制酶的β亚基和宿主细胞原有的α、γ、δ亚基自动装配成RNA复制酶以后，就进行RNA复制。以侵染的噬菌体RNA作模板，通过RNA复制酶合成互补的RNA链。常把具有mRNA功能的链称为正链，与它互补的链称为负链。在噬菌体特异的复制酶装配好后不久酶就吸附到正链RNA的3′末端，以它为模板合成出负链，至合成结束，然后负链从正链模板上释放出来。同一个酶又吸附到负链RNA的3′末端，合成出病毒正链RNA，正链RNA与外壳蛋白装配成噬菌体颗粒，所以正链和负链的合成方向都是由5′→3′。

（八）基因工程的操作技术

1．目的基因

体外操作DNA的主要步骤之一是提取载体DNA和所需要的外源目的基因。在细胞中DNA并非以游离态分子存在，而是和RNA及蛋白质结合在一起形成复合体。DNA纯化的基本步骤是：（1）从破坏的细胞壁和膜里释放出可溶性的DNA；（2）通过变性或蛋白质分解，使DNA和蛋白质的复合体解离；（3）将DNA从其它大分子中分离出来；（4）DNA浓度和纯度的光学测定。

2．载体

外源DNA片段（目的基因）要进入受体细胞，必须有一个适当的运载工具将带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体。

载体必须具备下列条件：（1）在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。所以载体本身必须是一个复制单位，称复制子（replicon），具有复制起点。而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。（2）易于鉴定、筛选。也就是说，容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来。（3）易于引入受体细胞。

常用的载体主要有以下几类：细菌和酵母的质粒，λ噬菌体和M13以及病毒。

3．连接  

外源DNA与载体DNA之间可以通过多种方式相连接，主要有以下几种(1) 粘性末端连接；(2) 平头末端连接；(3) 接头连接等。

4．转化  

任何外源DNA重组到载体上，然后转入受体细胞中复制繁殖，这一过程称为DNA的克隆。外源DNA进入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程称为转化。转化作用是将外源DNA引入细胞的过程。

5．筛选  由于细胞转化的频率较低，所以从大量的宿主细胞中筛选出带有重组体的细胞并不是很容易的，当前，在实验室中，常用的筛选手段有以下几种：(1) 插入失活；(2) 菌落原位杂交；(3) 免疫学方法．此外，对重组体转化的鉴定还可以采用表现型的鉴定；对重组质粒纯化并重新转化；限制性酶切图谱的绘制；重组质粒上的基因定位等更深入的方法。

 

二、习  题

 

（一）名词解释

1．半保留复制（semiconservative replication）

2．不对称转录（asymmetric trancription）

3．逆转录（reverse transcription）

4．冈崎片段（Okazaki fragment）

5．复制叉（replication fork）

6．领头链（leading strand）

7．随后链（lagging strand）

8．有意义链（sense strand）

9．光复活（photoreactivation）

10．重组修复（recombination repair）

11．内含子（intron）

12．外显子（exon）

13．基因载体（genonic vector）   

14．质粒（plasmid）

 

（二）填空题

1．DNA复制是定点双向进行的，     股的合成是     ，并且合成方向和复制叉移动方向相同；     股的合成是     的，合成方向与复制叉移动的方向相反。每个冈崎片段是借助于连在它的     末端上的一小段     而合成的；所有冈崎片段链的增长都是按     方向进行。

2．DNA连接酶催化的连接反应需要能量，大肠杆菌由     供能，动物细胞由     供能。

3．大肠杆菌RNA聚合酶全酶由     组成；核心酶的组成是     。参与识别起始信号的是     因子。

4．基因有两条链，作为模板指导转录的那条链称     链。

5．以RNA为模板合成DNA称     ，由     酶催化。

6．DNA或UpGpCpA分别经0.3NKOHR、NaseT1和牛胰RNaseI处理所得结果：

DNA: 0.3NKOH：       ；RNaseT1：       ；RNase I：       ;

UpGpCpA：0.3NKOH：        ；RNaseT1：        ；RNase I ：        。

7．基因突变形式分为：     ，     ，     和     四类。

8．亚硝酸是一个非常有效的诱变剂，因为它可直接作用于DNA，使碱基中     基氧化成     基，造成碱基对的     。

9．所有冈崎片段的延伸都是按      方向进行的。

10．前导链的合成是      的，其合成方向与复制叉移动方向      ；随后链的合成是      的，其合成方向与复制叉移动方向      。

11．引物酶与转录中的RNA聚合酶之间的差别在于它对      不敏感，并可以       作为底物。

12．DNA聚合酶I的催化功能有     、     、     、     和     。

13．DNA回旋酶又叫     ，它的功能是     。

14．细菌的环状DNA通常在一个     开始复制，而真核生物染色体中的线形DNA可以在     起始复制。

15．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的     活性使之具有     功能，极大地提高了DNA复制的保真度。

16．大肠杆菌中已发现     种DNA聚合酶，其中     负责DNA复制，     负责DNA损伤修复。

17．DNA切除修复需要的酶有     、     、     和     。

18．在DNA复制中，     可防止单链模板重新缔合和核酸酶的攻击。

19．DNA合成时，先由引物酶合成     ，再由     在其3′ 端合成DNA链，然后由     切除引物并填补空隙，最后由     连接成完整的链。

20．原核细胞中各种RNA是     催化生成的，而真核细胞核基因的转录分别由     种RNA聚合酶催化，其中rRNA基因由     转录，hnRNA基因由     转录，各类小分子量RAN则是     的产物。

21．一个转录单位一般应包括     序列、     序列和     顺序。

22．真核细胞中编码蛋白质的基因多为     。编码的序列还保留在成熟mRNA中的是     ，编码的序列在前体分子转录后加工中被切除的是     。在基因中     被

      分隔，而在成熟的mRNA序列被拼接起来。

23．染色质中的     蛋白和     蛋白对转录均有调节作用，其中     的调节作用具有组织特异性。

 

（三）选择题

1．DNA按半保留方式复制。如果一个完全放射标记的双链DNA分子，放在不含有放射标记物的溶液中，进行两轮复制，所产生的四个DNA分子的放射活性将会怎样：

A．半数分子没有放射性            B．所有分子均有放射性

C．半数分子的两条链均有放射性    D．一个分子的两条链均有放射性

E．四个分子均无放射性

2．参加DNA复制的酶类包括：（1）DNA聚合酶Ⅲ；（2）解链酶；（3）DNA聚合酶Ⅰ；（4）RNA聚合酶（引物酶）；（5）DNA连接酶。其作用顺序是：

A．（4）、（3）、（1）、（2）、（5）      B．（2）、（3）、（4）、（1）、（5）

C．（4）、（2）、（1）、（5）、（3）      D．（4）、（2）、（1）、（3）、（5）

E．（2）、（4）、（1）、（3）、（5）

3．如果15N标记的大肠杆菌转入14N培养基中生长了三代，其各种状况的DNA分子比例应是下列哪一项：

4．下列关于DNA复制特点的叙述哪一项错误的：

A．RNA与DNA链共价相连       B．新生DNA链沿5′→3′方向合成

C．DNA链的合成是不连续的      D．复制总是定点双向进行的

E．DNA在一条母链上沿5′→3′方向合成，而在另一条母链上则沿3′→5′方向合成 

5．DNA复制时， 5′—TpApGpAp－3′序列产生的互补结构是下列哪一种：

A．5′—TpCpTpAp－3′            B．5′—ApTpCpTp－3′

C．5′—UpCpUpAp－3′                                D．5′—GpCpGpAp－3′  

E．3′           —TpCpTpAp－5′

6．下列关于DNA聚合酶I的叙述哪一项是正确的：

A．它起DNA修复酶的作用但不参加DNA复制过程

B．它催化dNTP聚合时需要模板和引物

C．在DNA复制时把冈崎片段连接成完整的随从链

D．它催化产生的冈崎片段与RNA引物链相连

E．有些细菌突变体其正常生长不需要它

7．下列关于真核细胞DNA聚合酶活性的叙述哪一项是正确的：

A．它仅有一种                   B它不具有核酸酶活性

C．它的底物是二磷酸脱氧核苷     D它不需要引物

E．它按3′-5′方向合成新生链

8．从正在进行DNA复制的细胞分离出的短链核酸——冈崎片段，具有下列哪项特性：

A．它们是双链的                 B．它们是一组短的单链DNA片段

C．它们是DNA—RNA杂化双链    D．它们被核酸酶活性切除

E．它们产生于亲代DNA链的糖-磷酸骨架的缺口处

9．切除修复可以纠正下列哪一项引起的DNA损伤：

A．碱基缺失             B．碱基插入          C．碱基甲基化

D．胸腺嘧啶二聚体形成   E．碱基烷基化

10．大肠杆菌DNA连接酶需要下列哪一种辅助因子？

A．FAD作为电子受体               B．NADP+作为磷酸供体

C．NAD+形成活性腺苷酰酶          D．NAD+作为电子受体

E．以上都不是

11．下列关于RNA和DNA聚合酶的叙述哪一项是正确的：

A．RNA聚合酶用二磷酸核苷合成多核苷酸链

B．RNA聚合酶需要引物，并在延长链的5′端加接碱基

C．DNA聚合酶可在链的两端加接核苷酸

D．DNA仅能以RNA为模板合成DNA

E．所有RNA聚合酶和DNA聚合酶只能在生长中的多核苷酸链的3′端加接核苷酸

12．紫外线照射引起DNA最常见的损伤形式是生成胸腺嘧啶二聚体。在下列关于DNA分子结构这种变化的叙述中，哪项是正确的：

A．不会终止DNA复制

B．可由包括连接酶在内的有关酶系统进行修复

C．可看作是一种移码突变

D．是由胸腺嘧啶二聚体酶催化生成的

E．引起相对的核苷酸链上胸腺嘧啶间的共价联结

13．下列哪种突变最可能是致死的：

A．腺嘌呤取代胞嘧啶          B．胞嘧啶取代鸟嘌呤

C．甲基胞嘧啶取代胞嘧啶      D．缺失三个核苷酸

E．插入一个核苷酸

14．镰刀形红细胞贫血病是异常血红蛋白纯合子基因的临床表现。β-链变异是由下列哪种突变造成的：

A．交换      B．插入     C．缺失     D．染色体不分离     E．点突变

15．在培养大肠杆菌时，自发点突变的引起多半是由于：

A．氢原子的互变异构移位            B．DNA糖-磷酸骨架的断裂

C．插入一个碱基对      D．链间交联      E．脱氧核糖的变旋

16．插入或缺失碱基对会引起移码突变，下列哪种化合物最容易造成这种突变：

A．口丫啶衍生物      B．5-溴尿嘧啶

C．氮杂丝氨酸      D．乙基乙磺酸       E．咪唑硫嘌呤

17．在对细菌DNA复制机制的研究中，常常用到胸腺嘧啶的类似物5-溴尿嘧啶，其目的在于：

A．引起特异性移码突变以作为顺序研究用

B．在胸腺嘧啶参入部位中止DNA合成

C．在DNA亲和载体中提供一个反应基

D．合成一种密度较高的DNA以便用离心分离法予以鉴别

E．在DNA中造成一个能被温和化学方法裂解的特异部位

18．关于DNA指导的RNA合成，下列叙述哪一项是错误的：

A．只有在DNA存在时，RNA聚合酶才能催化磷酸二酯键的生成

B．转录过程中，RNA聚合酶需要引物

C．RNA链的合成是从5′→3′端

D．大多数情况下只有一股DNA链作为模板

E．合成的RNA链从来没有环状的

19．下列关于σ因子的叙述哪一项是正确的：

A．是RNA聚合酶的亚基，起辨认转录起始点的作用

B．是DNA聚合酶的亚基，容许按5′→3′和3′→5′双向合成

C．是50S核蛋白体亚基，催化肽链生成

D．是30S核蛋白体亚基，促进mRNA与之结合

E．在30S亚基和50S亚基之间起搭桥作用，构成70S核蛋白体

20．真核生物RNA聚合酶I催化转录的产物是：

A．mRNA          B．45S-rRNA

C．5S-rRNA        D．tRNA         E．SnRNA

21．下列关于真核细胞DNA复制的叙述哪一项是错误的：

A．是半保留式复制       B．有多个复制叉

C．有几种不同的DNA聚合酶       D．复制前组蛋白从双链DNA脱出

E．真核DNA聚合酶不表现核酸酶活性

22．下列关于原核细胞转录终止的叙述哪一项是正确的：

A．是随机进行的              B．需要全酶的ρ亚基参加

C．如果基因的末端含G—C丰富的回文结构则不需要ρ亚基参加

D．如果基因的末端含A—T丰富的片段则对转录终止最为有效

E．需要ρ因子以外的ATP酶

23．下列关于大肠杆菌DNA连接酶的叙述哪些是正确的：

A．催化DNA双螺旋结构之断开的DNA链间形成磷酸二酯键

B．催化两条游离的单链DNA分子间形成磷酸二酯键

C．产物中不含AMP

D．需要ATP作能源

24．下列关于真核细胞mRNA的叙述不正确的是：

A．它是从细胞核的RNA前体—核不均RNA生成的

B．在其链的3′端有7-甲基鸟苷，在其5′端连有多聚腺苷酸的PolyA尾巴

C．它是从前RNA通过剪接酶切除内含子连接外显子而形成的

D．是单顺反子的

 

（四）是非判断题

（ ）1．中心法则概括了DNA在信息代谢中的主导作用。

（ ）2．原核细胞DNA复制是在特定部位起始的，真核细胞则在多个位点同时起始进行复制。

（ ）3．逆转录酶催化RNA指导的DNA合成不需要RNA引物。

（ ）4．原核细胞和真核细胞中许多mRNA都是多顺反子转录产物。

（ ）5．因为DNA两条链是反向平行的，在双向复制中一条链按5′→3′的方向合成，另一条链按3′→5′的方向合成。

（ ）6．限制性内切酶切割的DNA片段都具有粘性末端。

（ ）7．已发现一些RNA前体分子具有催化活性，可以准确地自我剪接，被称为核糖酶（ribozyme），或称核酶。

（ ）8．重组修复可把DNA损伤部位彻底修复。

（ ）9．原核生物中mRNA一般不需要转录后加工。

（ ）10．RNA聚合酶对弱终止子的识别需要专一的终止因子(如蛋白)。

（ ）11．原核细胞启动子中RNA聚合酶牢固结合并打开DNA双链的部分称为Pribnow box，真核细胞启动子中相应的顺序称为Hogness box，因为富含A-T，又称TATA box。

（ ）12．增强子（endancer）是真核细胞DNA上一类重要的转录调节元件，它们自己并没有启动子活性，却具有增强启动子活性转录起始的效能。

 

（五）问答题

1. 简述中心法则。

2.       DNA复制的基本规律？

3.       简述DNA复制的过程？

4.       简述DNA复制时酶系。

5. 简述原核细胞和真核细胞的RNA聚合酶有何不同？

6. 简述RNA转录的过程？

7. 简述基因工程过程。

 

三、参 考 答 案

 

（一）名词解释

1．半保留复制：双链DNA的复制方式，其中亲代链分离，每一子代DNA分子由一条亲代链和一条新合成的链组成。

2．不对称转录：转录通常只在DNA的任一条链上进行，这称为不对称转录。

3．逆转录：Temin和Baltimore各自发现在RNA肿瘤病毒中含有RNA指导的DNA聚合酶，才证明发生逆向转录，即以RNA为模板合成DNA。

4．冈崎片段：一组短的DNA片段，是在DNA复制的起始阶段产生的，随后又被连接酶连接形成较长的片段。在大肠杆菌生长期间，将细胞短时间地暴露在氚标记的胸腺嘧啶中，就可证明冈崎片段的存在。冈崎片段的发现为DNA复制的科恩伯格机理提供了依据。

5．复制叉：复制 DNA分子的 Y形区域。在此区域发生链的分离及新链的合成。

6．领头链：DNA的双股链是反向平行的，一条链是5/→3/方向，另一条是3/→5/方向，上述的起点处合成的领头链，沿着亲代DNA 单链的3/→5/方向（亦即新合成的DNA沿5/→3/方向）不断延长。所以领头链是连续的。

7．随后链：已知的DNA聚合酶不能催化DNA链朝3/→5/方向延长，在两条亲代链起点的3/ 端一侧的DNA链复制是不连续的，而分为多个片段，每段是朝5/→3/方向进行，所以随后链是不连续的。

8．有意义链：即华森链，华森——克里格型DNA中，在体内被转录的那股DNA链。简写为W strand。

9．光复活：将受紫外线照射而引起损伤的细菌用可见光照射，大部分损伤细胞可以恢复，这种可见光引起的修复过程就是光复活作用。

10．重组修复：这个过程是先进行复制，再进行修复，复制时，子代DNA链损伤的对应部位出现缺口，这可通过分子重组从完整的母链上，将一段相应的多核苷酸片段移至子链的缺口处，然后再合成一段多核昔酸键来填补母链的缺口，这个过程称为重组修复。

11．内含子：真核生物的mRNA前体中，除了贮存遗传序列外，还存在非编码序列，称为内含子。

12．外显子：真核生物的mRNA前体中，编码序列称为外显子。

13．基因载体：外源DNA片段（目的基因）要进入受体细胞，必须有一个适当的运载工具将带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体。

14．质粒：是一种在细菌染色体以外的遗传单元，一般由环形双链DNA构成，其大小从1—200Kb。

 

（二）、填空题答案

1．领头链；连续的；随从链；不连续的；5′；RNA；5′ →3′。

2．NAD+；ATP。

3．；；

4．有意义链。

5．反向转录；逆转录酶。

6．不作用；不作用；不作用；Up+Gp+Cp+A；UpGp+CpA；GpCp+Up+A；

7．转换；颠换；插入；缺失。

8．氨基；酮基；转换。

9．5′→3′ 

10．连续 相同  不连续  相反

11．利福平  dNTP

12．5′→3′聚合  3′→5′外切  5′→3外切  焦磷酸解作用，焦磷酸交换作用

13．拓朴异构酶  使超螺旋DNA变为松驰状

14．复制位点  多位点  

15．3′→5′核酸外切酶  校对

16．3  DNA聚合酶Ⅲ  DNA聚合酶Ⅱ

17．专一的核酸内切酶   解链酶   DNA聚合酶Ⅰ  DNA连接酶  

18．SSB（单链结合蛋白）

19．RNA引物  DNA聚合酶Ⅲ  DNA聚合酶Ⅰ  DNA连接酶

20．同一RNA聚合酶  3  RNA聚合酶Ⅰ  RNA聚合酶Ⅱ  RNA聚合酶Ⅲ

21．启动子  编码  终止子

22．隔裂基因  外显子  内含子  外显子  内含子

23．组  非组    非组

 

（三）选择题

1．（A）DNA半保留复制需要来自亲代的每一条标记链作模板合成互补链，以保持与亲代相同的完整结构。因此，在无记溶液中进行第一轮复制将产生两个半标记分子。第二轮复制将产生两个半标记分子和两个不带标记的双链DNA分子。

2．（E）在DNA真正能够开始复制之前，必须由解链酶使DNA双链结构局部解链。在每股单链DNA模板上，由RNA聚合酶（引物酶）催化合成一小段（大约10—50个核苷酸）互补RNA引物。然后由DNA聚合酶Ⅲ向引物3′端加入脱氧核苷—5′—三磷酸，从5′→3′方向合成DNA片段（冈崎片段），直至另一RNA引物的5′末端。接着在DNA聚合酶Ⅰ的作用下将RNA引物从5′端逐步降解除去与之相邻的DNA片段由3′端延长，以填补RNA除去后留下的空隙。最后由DNA连接酶将DNA片段连接成完整连续的DNA链。

3．（D）DNA复制三代后，每八个完整DNA双链中将有两个双链分子含有一股亲代链。

4．（E）DNA是由DNA聚合酶Ⅲ复合体复制的。该酶催化脱氧三磷酸核苷以核苷酸的形式加到RNA引物链上，选择只能与亲链DNA碱基互补配对的核苷酸参入。参入的第一个脱氧核苷酸以共价的磷酸二酯键与引物核苷酸相连。链的生长总是从5′向3′延伸的。DNA复制开始于特异起始点，定点双向进行。

5．（A）DNA复制必需胸腺嘧啶（T）与腺嘌呤（A）配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对，从而使双螺旋两链之间部分地靠氨基与酮基间形成的氢键维系起来。链本身是反向平行方向合成的，即题中所述之磷酸二酯键的5′→3′顺序决定其沿3′→5′方向互补。

6．（B）DNA聚合酶Ⅰ在起聚合酶作用时必需要有模板和引物。这个一条肽链的蛋白质除聚合酶活性外还具有3′和5′外切核酸酶活性。在正常DNA复制时，它的作用是水解RNA引物链（5′→3′外切核酸酶活性）并用模板指导的脱氧核苷酸取代它们（聚合功能）。DNA聚合酶Ⅰ也参与DNA修复。例如在切除胸腺嘧啶二聚体中起5′→3′外切核酸酶的作用。在正常DNA复制时，DNA聚合酶Ⅰ表现3′外切核酸酶活性，切除错误参入的脱氧核苷酸残基。冈崎片段是由DNA聚合酶Ⅲ复合体产生的，而不是DNA聚合酶Ⅰ。在除去RNA引物链后，DNA片段通过DNA连接酶连接。DNA聚合酶Ⅱ，其功能目前还不清楚，一些细菌突变体，虽无DNA聚合酶Ⅱ，但却能正常生长。DNA聚合酶Ⅰ则是正常生长所必需的。

7．（B）真核生物中有三种DNA聚合酶，αβ及γ。DNApolα在细胞核DNA复制中起作用；DNApolβ在细胞核DNA修复中起作用；而DNApolγ则在线粒体DNA复制中起作用。它们都需要引物，都用脱氧三磷酸核苷作底物，都按5′→3′方向合成新生DNA链。真核生物DNA聚合酶任何一种均不表现核酸酶活性。

8．（B）DNA复制时，如果两股链按5′→3′方向先合成短的DNA片段，然后再连接成连续的链，这就能使DNA的两条反向互补链能够同时按5′→3′方向的聚合机制进行复制。冈崎首先从大肠杆菌中分离出正在复制的新生DNA，并发现这新生DNA是由一些不连续片段（冈崎片段）所组成。在大肠杆菌生长期间，将细胞短时间地暴露在氚标记的胸腺嘧啶中，在将细胞DNA变性处理（也就是解链）之后，冈崎分离得到了标记的DNA片段。它们是单链的，并且由于DNA聚合酶Ⅲ复合体用RNA作引物，因此新生冈崎片段以共价键连着小段RNA链，但它们既不是碱基互补的RNA—DNA双链杂合体，也不是来自亲链的片段。新生冈崎片段决不会被核酸酶切除。

9．（D）DNA链内胸腺嘧啶二聚体可因紫外线（UV）照射而形成。专一的修复系统依赖UV—特异的内切核酸酶，它能识别胸腺嘧啶二聚体，并且通常在二聚体5′侧切断磷酸二酯键从而在DNA链内造成一个缺口。损伤序列的切除以及用完整的互补链作为模板重新合成切去的片段都是由DNA聚合酶Ⅰ来完成的。主链与新合成片段之间的裂口则由DNA连接酶接合。碱基缺失、插入、甲基化，或烷基化均不能作为切除修复体系靶子而为UV—特异性内切核酸酶所识别。

10．（C）DNA连接酶能够连接留有缺口的DNA链或闭合单股DNA链以形成环状 DNA分子。该酶需要一股链末端的游离3/-OH和另一股链末端的5/-磷酸，并且要求这两股链是双链DNA的一部分。反应是吸能的，因此需要能源。在大肠杆菌和其它细菌中，能源是NAD+分子中的焦磷酸键。NAD+先与酶形成酶—AMP复合物，同时释放叮NAD的尼克酰胺单核苷酸；酶一AMP复合物上的AMP再转移到DNA链的5/-磷酸基上，使其活化，然后形成磷酸二酯键并释放AMP。

11．（E）RNA聚合酶和DNA聚合酶都是以三磷酸核苷（NTP或dNTP）为其底物，这两种聚合酶都是在生长中的多核苷酸链的3′端加接核苷酸单位。DNA聚合酶合成与DNA互补的DNA。合成与RNA互补的DNA的酶称作逆转录酶。

12．（B）紫外线（260nm）照射可引起DNA分子中同一条链相邻胸腺嘧啶之间形成二聚体，并从该点终止复制。该二聚体可由包括连接酶在内的酶系切除和修复，或在光复合过程中，用较长（330—450nm）或较短（230nm）波长的光照射将其分解。

13．（E）DNA链中插入一个额外核苷酸会引起移码突变并使突变点以后转录的全部mRNA发生翻译错误。题中列出的所有其它突变通常仅引起一个氨基酸的错误（如题中的A或B），或从氨基酸序列中删除一个氨基酸（D），或在氨基酸顺序中完全没有错误。需要指出的是，如果A或B突变导致生成“无意义”或链终止密码子，则这种突变所造成的后果也会象移码突变那样是致死的。

14．（E）在Hbs中，β链上一个缬氨酸残基替换了谷氨酸，这是由于一个核苷酸碱基的点突变所造成的后果。即位于三联体第二位的胸腺嘧啶转换为腺嘌呤。

15．（A）自发点突变多半是由于嘌呤或嘧啶碱中氢原子的互变异构移位而引起的。在DNA复制中，这种移位会引起碱基配对的改变。某些诱变剂如5—溴尿嘧啶和2—氨基嘌呤可促进DNA碱基的互变异构。

16．（A）吖啶衍生物可导致一个碱基对的插入或缺失，从而引起移码突变。5—溴尿嘧啶可引起转换突变，因为溴取代了胸腺嘧啶的甲基，这样则增加了烯醇式互变异构物与鸟嘌呤而不是腺嘌呤进行碱基配对的可能性。咪唑硫嘌呤可转变为6—巯基嘌呤，后者是嘌呤的类似物。乙基乙磺酸可通过使鸟嘌呤烷基化引起转换突变。

17．（D）5—溴尿嘧啶可代替胸腺嘧啶参入到DNA中，从而产生密度较高的DNA。然后可在氯化铯密度梯度中用离心法对新合成的DNA进行定量分析。DNA中的5—溴尿嘧啶较正常胸嘧啶既不更活泼又不更易被断裂，也不能象吖啶染料那样引起移码突变。

18．（B）RNA聚合酶必须以DNA为模板催化合成RNA，通常只转录双螺旋DNA其中的一条链。RNA链的合成方向是从5′到3′端，产物从来没有环状分子。与DNA聚合酶不同，RNA聚合酶不需要引物。

19．（A）σ因子是RNA聚合酶的一个亚基，σ因子本身没有催化功能，它的作用是与核心酶结合，对转录的起始特异性起决定性的作用。在有σ因子的情况下，RNA聚合酶将选择DNA准备转录的那条链，并在适当的启动基因部位开始转录。

20．（B）真核生物有三种RNA聚合酶，它们分别催化45S—rRNA（RAN聚合酶Ⅰ）mRNA和SnRNA（RNA聚合酶Ⅱ），以及tRNA和5S—rRNA（RNA聚合酶Ⅲ）的合成。这三种酶可以根据它们对抗生素α—鹅膏蕈碱的敏感度不同加以区别：RNA聚合酶Ⅰ耐受；RNA聚合酶Ⅱ极敏感；RNA聚合酶Ⅲ中等敏感。RNA聚合酶Ⅰ催化合成的45S原始转录本，经转录后加工而成为成熟的18S—rRNA，5.8S—rRNA和28S—rRNA。

21．（D）真核生物DNA在多个复制叉上按半保留方式复制。真核生物有三种DNA聚合酶：α、β及γ。分别参加细胞核DNA复制，细胞核DNA修复，以及线粒体DNA复制。真核生物DNA聚合酶一般都不具有核酸酶活性。真核DNA复制时，组蛋白不从DNA解离下来，而是留在含有领头子链的双链DNA上。新合成的组蛋白则与随从子链结合。

22．（C）原核细胞转录终止不是随机进行的，据目前所知有两种转录终止方式即依赖Rho (ρ)因子与不依赖Rho因子的方式。不依赖Rho因子的转录终止与转录产物形成二级结构有关，即在基因的末端含G—C丰富的回文结构，当RNA转录延长至该部位时，按模板转录出的RNA碱基序列会立即形成发夹型的二级结构，这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。Rho因子是RNA聚合酶之外的一种蛋白质，有控制转录终止的作用。Rho因子本身似乎就具有ATP酶的活性。

23．B：DNA连接酶催化DNA链两段之间形成磷酸二酯键，但这两段必须是在DNA双螺旋结构之中，它不能将两条游离的单链DNA分子连接起来。在大肠杆菌中，成键所需能量来自NAD，产物是AMP和烟酰胺单核苷酸；而在某些动物细胞以及噬菌体中，则以ATP作为能源。DNA连接酶在DNA合成、修复以及重组中都是十分重要的。

24．B：真核mRNA是从2至20千碱基长的细胞核RNA前体——核不均—RNA（hnRNA）形成的。所有真核mRNA5′端均具有5′—5′焦磷酸连接的7-甲基鸟苷（帽结构）。大多数真核mRNA的3′端连有150至200个核苷酸长度的聚腺苷酸尾链。从mRNA前体切除内含子是由具有高度专一性的酶性催化完成的。内含子是不被翻译的。真核生物mRNA是单顺反子的。

 

（四）是非题

1．对     2．对     3．错     4．错     5．错     6．错

7．对     8．错     9．对    10．对    11．对    12．对

（五）问答题

1．答：在细胞分裂过程中通过DNA的复制把遗传信息由亲代传递给子代，在子代的个体发育过程中遗传信息由DNA传递到RNA，最后翻译成特异的蛋白质；在RNA病毒中RNA具有自我复制的能力，并同时作为mRNA，指导病毒蛋白质的生物合成；在致癌RNA病毒中，RNA还以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。

2.答：（1）复制过程是半保留的。

（2）细菌或病毒DNA的复制通常是由特定的复制起始位点开始，真核细胞染色体DNA复制则可以在多个不同部位起始。

（3）复制可以是单向的或是双向的，以双向复制较为常见，两个方向复制的速度不一定相同。

（4）两条DNA链合成的方向均是从5’向3’方向进行的。

（5）复制的大部分都是半不连续的，即其中一条领头链是相对连续的，其他随后链则是不连续的。

（6）各短片段在开始复制时，先形成短片段RNA作为DNA合成的引物，这一RNA片段以后被切除，并用DNA填补余下的空隙。

3.答：DNA复制从特定位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。由于 DNA双链的合成延伸均为5′→3′的方向，因此复制是以半不连续的方式进行，可以概括为：双链的解开；RNA引物的合成；DNA链的延长；切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段。

（1）双链的解开  在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，形成复制叉，分别作为模板，各自合成其互补链。在复制叉上结合着各种各样与复制有关的酶和辅助因子。

（2）RNA引物的合成  引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成。移动和引发均需要由ATP提供能量。以DNA为模板按5′→3′的方向，合成一段引物RNA链。引物长度约为几个至10个核苷酸。在引物的5′端含3个磷酸残基，3′端为游离的羟基。

（3）DNA链的延长  当RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四种脱氧核糖核苷5′-三磷酸为底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出PPi。DNA链的合成是以两条亲代DNA链为模板，按碱基配对原则进行复制的。亲代DNA的双股链呈反向平行，一条链是5′→3′方向，另一条链是3′→5′方向。在一个复制叉内两条链的复制方向不同，所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为止还没有发现一种DNA聚合酶能按3′→5′方向延伸，因此子链中有一条链沿着亲代DNA单链的3′→5′方向（亦即新合成的DNA沿5′→3′方向）不断延长。

（4）切除引物，填补缺口，连接修复  当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3′-OH端与前面一条老片断的5′断接近时，在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，在引物RNA与DNA片段的连接处切去RNA引物后留下的空隙，由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶的作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，就形成了两个DNA双股螺旋分子。每个分子中一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。

4.答：（1）原核细胞大肠杆菌的RNA聚合酶研究的较深入。这个酶的全酶由5种亚基（α2ββ′δω）组成，还含有2个Zn原子。在RNA合成起始之后，δ因子便与全酶分离。不含δ因子的酶仍有催化活性，称为核心酶。δ亚基具有与启动子结合的功能，β亚基催化效率很低，而且可以利用别的DNA的任何部位作模板合成RNA。加入δ因子后，则具有了选择起始部位的作用，δ因子可能与核心酶结合，改变其构象，从而使它能特异地识别DNA模板链上的起始信号。

（2）真核细胞的细胞核内有RNA聚合酶I、II和III，通常由4～6种亚基组成，并含有Zn2+。RNA聚合酶I存在于核仁中，主要催化rRNA前体的转录。RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ存在于核质中，分别催化mRNA前体和小分子量RNA的转录。此外线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶，其特性类似原核细胞的RNA聚合酶。

5.答：RNA转录过程为起始位点的识别、起始、延伸、终止。

（1）起始位点的识别  RNA聚合酶先与DNA模板上的特殊启动子部位结合，σ因子起着识别DNA分子上的起始信号的作用。在σ亚基作用下帮助全酶迅速找到启动子，并与之结合生成较松弛的封闭型启动子复合物。这时酶与DNA外部结合，识别部位大约在启动子的-35位点处。接着是DNA构象改变活化，得到开放型的启动子复合物，此时酶与启动子紧密结合，在-10位点处解开DNA双链，识别其中的模板链。由于该部位富含A-T碱基对，故有利于DNA解链。开放型复合物一旦形成，DNA就继续解链，酶移动到起始位点。

（2）起始留在起始位点的全酶结合第一个核苷三磷酸。第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷酸掺入的位置称为转录起始点。这时σ亚基被释放脱离核心酶。

（3）延伸  从起始到延伸的转变过程，包括σ因子由缔合向解离的转变。DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA的结合松弛，核心酶可沿模板移动，并按模板序列选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3′-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向是沿DNA模板链的3′→5′方向按碱基酸对原则生成5′→3′的RNA产物。RNA链延伸时，RNA聚合酶继续解开一段DNA双链，长度约17个碱基对，使模板链暴露出来。新合成的RNA链与模板形成RNA-DNA的杂交区，当新生的RNA链离开模板DNA后，两条DNA链则重新形成双股螺旋结构。

（4） 终止  在DNA分子上有终止转录的特殊碱基顺序称为终止子，它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和释放RNA链的作用。这些终止信号有的能被RNA聚合酶自身识别，而有的则需要有ρ因子的帮助。ρ因子是一个四聚体蛋白质，它能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分。它的作用是阻RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。对于不依赖于ρ因子的终止子序列的分析，发现有两个明显的特征：即在DNA上有一个15～20个核苷酸的二重对称区，位于RNA链结束之前，形成富含G-C的发夹结构。接着有一串大约6个A的碱基序列它们转录的RNA链的末端为一连串的U。寡聚U可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。在真核细胞内，RNA的合成要比原核细胞中的复杂得多。

6. 答：（1）目的基因调取  体外操作DNA的主要步骤之一是提取载体DNA和所需要的外源目的基因。在细胞中DNA并非以游离态分子存在，而是和RNA及蛋白质结合在一起形成复合体。DNA纯化的基本步骤是:（1）从破坏的细胞壁和膜里释放出可溶性的DNA；（2）通过变性或蛋白质分解，使DNA和蛋白质的复合体解离；（3）将DNA从其它大分子中分离出来；（4）DNA浓度和纯度的光学测定。

（2）载体选择  外源DNA片段（目的基因）要进入受体细胞，必须有一个适当的运载工具将带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体。载体必须具备下列条件：①在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。所以载体本身必须是一个复制单位，称复制子，具有复制起点。而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。②易于鉴定、筛选。也就是说，容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来。③易于引入受体细胞。

（3）连接  外源DNA与载体DNA之间可以通过多种方式相连接，主要有以下几种：①粘性末端连接；②平头末端连接；③接头连接等。

（4）转化  任何外源DNA重组到载体上，然后转入受体细胞中复制繁殖，这一过程称为DNA的克隆。外源DNA进入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程称为转化。转化作用是将外源DNA引入细胞的过程。

（5）筛选  由于细胞转化的频率较低，所以从大量的宿主细胞中筛选出带有重组体的细胞并不是很容易的，当前，在实验室中，常用的筛选手段有以下几种：① 插入失活；② 菌落原位杂交；③ 免疫学方法．此外，对重组体转化的鉴定还可以采用表现型的鉴定；对重组质粒纯化并重新转化；限制性酶切图谱的绘制；重组质粒上的基因定位等更深入的方法。