生长素（IAA，分子量175）作为第一种被发现的植物激素，生长素几乎参与了植物生长发育调控的每一个过程。1928年，Went Fritz Warmolt用实验证明胚芽鞘尖端有一种可以促进生长的物质，将其称之为生长素。进一步研究确定生长素的化学本质是吲哚乙酸（IAA, Indole-3-acetic acid）。现代生物学研究发现PIN-FORMED (PIN)蛋白家族参与调控生长素从植物细胞胞质侧运输到胞外区，因此，PIN也被称为生长素转运蛋白3。区别于其它植物激素，生长素在细胞与细胞之间的运输过程具有方向性，这一过程也被称为极性运输而PIN家族蛋白就在其中发挥了关键作用。特定PIN家族成员在细胞质膜上具有不对称分布的特点，它们的分布位置决定了生长素“搬运”的方向。解析PIN蛋白的三维结构是生长素研究领域亟待解决的科学问题。NPA是之前在实验室广泛应用的一种生长素极性运输抑制剂，生化证据表明，NPA可以直接靶向PIN蛋白，但是究竟是如何发挥作用的一直不清楚。

      中国科学技术大学研究团队与浙江大学研究团队在这两篇研究论文中（图1），同时报道了植物中生长素极性转运蛋白PIN以及PIN与生长素IAA结合、PIN与除草剂NPA结合的三个高分辨率结构，并结合SPR及ITC分子互作技术阐明了膜蛋白PIN与生长素IAA（分子量175 Da）和除草剂NPA的识别和转运机制，为剖析植物生长素运输调控以及针对PIN蛋白的农业用除草剂和植物生长调节剂的设计开发奠定了重要基础。

      浙江大学研研究人员通过体外放射性3H-IAA转运实验，验证了AtPIN3的关键氨基酸残基在IAA转运和NPA抑制过程中的重要作用，通过表面等离子体共振技术（SPR）验证了关键氨基酸残基对IAA和NPA结合AtPIN3的亲和力的影响。3H-IAA外排实验和表面等离子体共振技术实验结果进一步验证了冷冻电镜结构中观察到的IAA和NPA与AtPIN3的结合模式。进一步，科研人员系统性地解析了AtPIN3在apo状态、底物（IAA）结合状态以及抑制剂（NPA）结合状态下的高分率结构，揭示了AtPIN3的结构、IAA识别机制以及NPA抑制的分子机制，将有力促进对PIN介导的生长素运输分子机制的理解，为靶向该转运体的创新农药研发打下基础。

      为验证IAA在蛋白PIN3上的结合位点与关键氨基酸，科研人员通过SPR实验发现，膜蛋白PIN3与IAA直接结合，亲和力KD为160.4 μM（图3）；对PIN3蛋白上关键氨基酸进行单点突变（V51A, N112A, L114A, V137A, Q140A, Y145A, I600A和V601A）后，其与IAA的亲和力显著降低，其中Y145A突变后亲和力降低最多，为402.2 μM（图4），实验结果表明，这些氨基酸位点对于IAA与PIN3的结合均很重要，从而确定了IAA在PIN3上结合的关键氨基酸，与结构的数据高度一致。

      为进一步验证除草剂NPA的结合位点是否与IAA结合位点相同，以及NPA抑制IAA的分子机制，科研人员通过Biacore实验发现，膜蛋白PIN3与NPA直接结合，亲和力KD为56.2 μM，强于IAA与PIN3的亲和力（160.4 μM）（图2）；对PIN3蛋白上IAA结合的关键氨基酸位点进行单点突变（V51A, N112A, L114A, V137A, Q140A, Y145A, I600A和V601A）后，结果同样显示，突变后与NPA的亲和力显著降低（图4），表明 NPA与PIN3的结合位点与IAA相同。因此，NPA通过直接结合PIN3蛋白上的IAA结合位点，以较高的亲和力抑制PIN3的IAA转运活性。最终，阐明了PIN3与生长素IAA和除草剂NPA的识别和转运机制。

      中国科学技术大学研究团队研究人员利用体外纳米抗体合成技术，筛选得到了靶向PIN1蛋白的纳米抗体，并利用冷冻电镜单颗粒重构技术，成功解析了PIN1、PIN1-IAA 和PIN1-NPA的结构(图5），分辨率为3.0埃的结构，首次揭示了经典PIN家族蛋白成员的三维结构。团队进一步解析了PIN1与生长素IAA、抑制剂NPA结合的复合体结构，揭示了PIN1蛋白“装载”生长素，以及NPA“鸠占鹊巢”阻制生长素“搬运”的全貌。 

       利用ITC及SPR分子互作技术检测证实， PIN1也能与生长素IAA直接结合，SPR技术测得亲和力KD为186 μM（图6）ITC技术测得的亲和力为83μM(图7），与PIN3与IAA的亲和力（KD为160.4 μM，图3）相当；同时，他们还检测了PIN1与其他天然生长素（IBA、IPA、4-Cl-IAA）均能结合（图6）。利用ITC技术检测了IAA及NPA与野生型PIN1及突变型PIN1的亲和力（图7、图8）。

Surface plasmon resonance 实验方法：

SPR experiments for IAA, indole-3-butyric acid (IBA), indole-3-propionic acid (IPA) and 4-chloroindole-3-acetic acid (4-Cl-IAA) were carried out on a Biacore 8K system (Cytiva) at 25 °C with a flow rate of 30 μl min−1. Purified wild-type PIN1 protein were immobilized onto the series S CM5 sensor chips (Cytiva) by amine-coupling chemistry. Ligands at different concentrations were flowed over the chip surface in the pH 7.0 buffer (25 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 0.01% GDN, 2% DMSO) or pH 5.5 buffer (25 mM MES, pH 5.5, 150 mM NaCl, 0.01% GDN, 2% DMSO). Data were analysed with the Biacore Insight Evaluation Software Version 3.0.12 using steady state affinity binding model

利用ITC技术检测了IAA及NPA与野生型PIN1及突变型PIN1的亲和力。

IAA-ITC results for the WT PIN1 at pH 5.5. c–f, IAA-ITC results for the PIN1 V51A, N112A, I582A and Y145A mutants at pH 7.0, respectively. No apparent binding are derived for the N112A, I582A and Y145A mutants. For V51A, the fitted binding affinity is 1.39 ± 0.16 mM, 17-fold higher than that of the WT PIN1. g, h, NPA-ITC results for the PIN1 N112A and Y145A mutants. i, Cartoon model for the alternating access mechanism of IAA transport by PIN1 and inhibition by NPA.

Isothermal titration calorimetry 实验方法：

The binding affinities between IAA and PIN1 variants were measured with a MicroCal iTC200 microcalorimeter (MicroCal). Purified wild-type or mutant PIN1 in the buffer containing 0.02% GDN, 25 mM HEPES pH 7.0 (or MES pH 5.5) and 150 mM NaCl were concentrated to about 0.05 mM for isothermal titration calorimetry titration. The protein was titrated by 5 mM IAA dissolved in an identical buffer to that used for size-exclusion chromatography at 25 °C. To measure the binding affinities between NPA and PIN1, 100 μM NPA in the buffer containing 1% DMSO, 0.02% GDN, 25 mM HEPES pH 7.0 and 150 mM NaCl was used to titrate to 0.01 mM purified protein in the identical buffer. Data were fitted using the software Origin 7.0 (MicroCal).

参考文献：

Yang, Zhisen et al. “Structural insights into auxin recognition and efflux by Arabidopsis PIN1.” Nature vol. 609,7927 (2022): 611-615. 

Su, Nannan et al. “Structures and mechanisms of the Arabidopsis auxin transporter PIN3.” Nature vol. 609,7927 (2022): 616-621. 

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