全是技巧！流式细胞术样品制备的9个秘诀！
样品材料非常珍贵，因此流式细胞术数据的可靠性和可重复性至关重要。 但是质量差的样品会导致下游灾难性的结果，我们可以通过改进流式细胞术样品制备以获得更可靠的结果。
无论在研究什么样的细胞类型，如下样本制备提示会有助于从流式实验中获得最大的收获。
Part.1 确保培养细胞健康
培养的细胞对环境因素如温度、pH和湿度极为敏感。因此，对于适合流式细胞仪实验的培养箱而言，CO2培养箱的良好维护和不超载以及门的开度保持在最小值是至关重要的。细胞的行为也受到合流的影响，细胞保持对数生长非常重要，防止细胞死亡，也防止因此导致的成团。在细胞需要传代时，避免苛刻的离心和使用温和的分离试剂如 Accutase®可以帮助减轻聚集。
Part.2 检查细胞浓度
除了在常规繁殖过程中对细胞进行计数以确认生长是否如预期进行外，计数对于确保实验间样品的一致性也至关重要。自动细胞计数器用于更可靠的计数和消除用户偏差，将样本保持在最佳细胞浓度范围内。如果细胞太多，分析中可能会丢失有价值的事件，细胞太少则会显著延长运行时间。
Part.3 考虑使用活性染料
同时测量细胞浓度和评估细胞活力有助于监测细胞健康状况。它还可以提醒研究人员注意样品制备的任何有害影响，使研究方案能够在早期适应。吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）等试剂已成为广泛使用的台盼蓝（如果使用不当，台盼蓝可能具有细胞毒性）的首选替代品，并且容易与大多数自动计数系统兼容。
Part.4 确保处理的一致性
在许多情况下，细胞在流式细胞仪分析之前需要某种形式的处理。这可能是潜在的候选药物的不同剂量，刺激特定的酶，或诱导细胞因子信号通路。为了保证流式数据的质量，这些处理方法必须在实验之间保持一致。试剂添加通常涉及时间敏感的解冻步骤或极低体积的移液，为了提高实验的重现性，研究人员经常使用冻干粉状、预先配制好的常用激活剂混合物，比如贝克曼库尔特的DURActive stimulation kits，或者在方案中引入自动化液体处理系统。
Part.5 考虑富集稀有细胞群
目的细胞群含量很低时，可能需要进行靶富集。低含量细胞群流式分析，如循环肿瘤细胞或抗原特异性T细胞时，这种方法尤其有用。富集靶细胞的一种方法是磁珠富集，如美天妮的MACS® microbead technology。
Part.6 小心处理血液和组织样本
处理培养细胞与处理血液和组织材料的主要区别在于如何采集样本。血液和组织经常从长期的大型队列研究中获得，要求在流式细胞术分析之前保存样本。与样品保存相关的变异性可以通过使用专门的组织储存试剂、冷冻干燥和在-80℃保存材料来降低。组织随后进行机械离解，组织特异性离解缓冲液，如美天妮的组织离解试剂盒gentleMACS™ 解离剂可以更好地保留表位。
Part.7 过滤样本以去除团块
通过适当孔径的细胞过滤器过滤样本是一种快速简便的方法，可以去除任何可能使下游分析复杂化或堵塞流式细胞仪的团块。几乎所有的流式细胞术方案都可以从过滤样本中获益，而显微镜下的快速检查将确认没有残留的团块。
Part.8 防止细胞粘在一起
制备好了单细胞悬浮液，重要的是要防止细胞粘在一起。使用不含Ca2+/Mg2+且含有高达2%蛋白质的再悬浮缓冲液。样本中加入DNase也会有帮助，以清除任何释放的DNA，这些DNA可能会导致团块的形成。另一点值得注意的是，细胞能够结合到塑料制品；使用聚丙烯管可以帮助减少对管壁的结合。
Part.9 提前计划免疫染色
多色免疫染色抗体的选择和面板的设计非常重要，仪器配置和性能表现、抗体的克隆、抗原表达丰度、染料亮度和染料间的相互影响都是面板设计时需要考虑的因素。可以使用各个网站的相关工具帮助实现更好的面板设计，如FluoroFinder的光谱查看器（Spectra Viewer），可以在一个直观的平台上快速比较来自所有供应商的800多种荧光色素，而FluoroFinder的面板生成器（Panel Builder）能够利用100多家供应商的最新荧光色素和抗体产品设计最佳的多色流式细胞术实验。
Reference
https://fluorofinder.com/newsletter-tips-and-tools-for-flow-cytometry-sample-prep-success/
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