细胞复苏的小技巧

1⃣️实验前准备

实验开始前，将无菌培养瓶，15mL离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。然后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。将离心机调节至 800rpm，5min。水浴箱调节至 37 度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。消毒双手和超净台。取约 10mL细胞完全培养基放于 15mL离心管中。实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到 37 度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在 1 min以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约 1min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

2⃣️制备细胞悬液

以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打 5 次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中 DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心 5min。

3⃣️细胞计数

采用罗氏 CASY-DT 快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入 10mLCASY-ton 至以标记 viable 的管子中，加入 100uL细胞悬液，颠倒混匀3次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞 2 乘 10 的 5 次方。

4⃣️细胞培养

离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入 10mL细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，左右轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入 37℃，5％CO2 的培养箱中培养， 2-4 h或者 24-48 h后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定，一般以大部分细胞状态良好时换液为宜，比如超过半数的细胞贴壁，即可换液。