PCR 的每个阶段会发生什么？

变性阶段

• 在此阶段，包含模板 DNA 和所有其他核心成分的混合物被加热到 94-95⁰C。

• 高温导致氢键在两条模板 DNA 链中的碱基之间断裂，两条链分开。

• 这会产生两条单链 DNA，它们将充当生成新 DNA 链的模板。

• 重要的是，温度在此阶段保持足够长的时间以确保 DNA 链完全分离。

• 这通常需要 15-30 秒。

退火阶段

在此阶段，反应冷却至 50-65⁰C。这使得引物能够通过氢键结合到单链模板 DNA 的特定位置（确切的温度取决于您使用的引物的熔化温度）。

引物是单链DNA或者RNA：长度约为 20 到 30 个碱基的序列。

引物设计成互补的：在要复制的序列的每一端按顺序排列成短的 DNA 片段。

引物是 DNA 合成的起点。聚合酶只能将 DNA 碱基添加到 DNA 双链中。只有当引物结合后，聚合酶才能附着并开始从松散的 DNA 碱基中制造新的 DNA 互补链。

两条分开的 DNA 链是互补的，并且方向相反（从一端 - 5' 端 - 到另一端 - 3' 端）；因此，有两种引物——正向引物和反向引物。

此步骤通常需要大约 10-30 秒。

延伸阶段

在最后一步中，热量增加到 72⁰C，使新的 DNA 能够通过添加 DNA 碱基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成。

Taq DNA 聚合酶是一种从喜热细菌中提取的酶。这种细菌通常生活在温泉中，因此可以承受 80⁰C 以上的温度。

细菌的 DNA 聚合酶在高温下非常稳定，这意味着它可以承受在 PCR 变性阶段将 DNA 链分开所需的温度。

72⁰C 是 Taq 聚合酶构建互补链的最佳温度。它附着在引物上，然后以 5' 到 3' 的方向将 DNA 碱基一个接一个地添加到单链上。

结果是一条全新的 DNA 链和一个双链 DNA 分子。

此步骤的持续时间取决于被扩增的 DNA 序列的长度，但通常需要大约一分钟来复制 1,000 个 DNA 碱基 (1Kb)。

这三个热循环过程重复 20-40 次以产生大量感兴趣的 DNA 序列拷贝。

图2：显示聚合酶链式反应 (PCR) 如何产生大量 DNA 拷贝。