生信小白一定要学会的铜死亡单基因分析思路！单细胞分析+干湿结合，轻松get 4分+！

2023-06-25 19:00 作者:生信鸟 0人读过 | 我要投稿

已经快到年中了，但是铜死亡的热度依然不减。铜死亡的单基因分析、预后模型构建、泛癌分析等依然是生信圈人关注的重点。布小谷今天发现的一篇文章，便是一篇4分+的FDX1的单基因分析。

FDX1基因作为铜死亡中研究最早也是最多的基因，布小谷之前也介绍过很多次（想了解的朋友去看布小谷往期推送的文章哦！！！）。这篇文章前面是铜死亡相关单细胞数据分析结合免疫浸润分析，后面加上关键基因的体外实验验证这个buff，准确性大大增加，内容稳妥不出错，4分+实至名归！！！生信小白学会这个思路，随便换个其他基因，结合临床实验，也能轻松发表高分文章！！！废话不多说，上车～～～

l 题目：结肠腺癌（COAD）中铜死亡相关基因FDX1的高表达与良好预后和免疫细胞浸润的关系

l 杂志：J Cancer Res Clin Oncol

l 影响因子：4.3220

l 发表时间：2023年1月

研究背景

结肠腺癌（COAD）是全球第三种常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。FDX1是铜离子团诱导的细胞死亡的关键调节器，也是蛋白质脂酰化的上游调节器；FDX1敲除后，蛋白质脂酰化完全丧失，使细胞免受铜的毒性影响。然而，铜死亡相关基因FDX1在COAD中的临床影响仍基本不清楚。

数据来源

研究思路

将FDX1的表达通过癌症基因组图谱（TCGA）数据库和人类蛋白质图谱（HPA）数据库进行分析。通过Kaplan-Meier（KM）生存曲线研究FDX1表达与COAD预后的关系。使用R包DESeq2和stat从TCGA数据库中筛选了COAD中FDX1的差异表达基因（DEGs）和功能相关基因，并通过STRING数据库构建PPI网络。通过Cytoscape软件分析PPIs，并筛选出hub基因。CancerSEA数据库被用来分析FDX1的表达水平对COAD细胞不同功能状态的影响，TIMER2.0数据库分析了FDX1表达与COAD免疫浸润的关系。最后，通过Western Blot筛选出高表达FDX1的结肠癌患者，并通过流式细胞仪检测免疫浸润水平。

主要结果

1. FDX1的mRNA表达和与生存关系的分析

通过分析TCGA数据库中的FDX1在33种癌症中的表达水平得出，FDX1在大多数癌症（BRCA等）包括COAD中表达均较低（图1B）。HPA数据库的免疫组化结果显示，FDX1在正常结肠组织的粘膜上皮、固有层和粘膜下层都有表达（图1C），但在结肠癌细胞组织中没有明显的表达（图1D）。

根据Kaplan-Meier生存曲线分析，FDX1高表达的COAD患者的总生存期（OS）和疾病特异性生存期（DSS）均高于低表达组（图2A，B）。此外，在不同的临床变量如T4期中，FDX1的高表达对预后（OS）也有积极影响（图2C）。

2. 与COAD中FDX1密切相关的基因分析

FDX1在COAD中的前25个功能相关基因显示在热图中，显示出持续上调或下调（图3A）。使用使用R软件包DESeq2和stat从TCGA数据库中筛选了364个FDX1的高表达和低表达患者的差异基因，作者发现在这些DEGs中，下调最多的基因是GPR52等，上调最多的基因是MAGEB2等（图3 B）。基因本体论显示，在分子功能（MF）方面，DEGs与味觉受体和苦味受体的活性有关；从细胞成分（CC）角度看，主要涉及DNA包装复合物和核糖体；在生物过程（BP）方面，这些DEGs主要参与核糖体组装、苦味的感觉感知。此外，对DEGs的KEGG富集分析显示，富集程度最高的3条信号通路分别是味觉转导、酒精中毒和系统性红斑狼疮（图3C）。

3. 建立PPI网络并检测hub基因

通过STRING工具构建了FDX1与其相关基因之间的蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）。结果显示，FDX1只与CYCS有相互作用（图4A）。从在PPI网络中检测到，PDX1与除CYCS外的NDUFC2、MT-ND4和SUHD交互频率较高，因此这些基因被认为是hub基因（图4B）。

4. FDX1的表达水平对不同变量的影响

1) FDX1在单细胞中的表达水平与肿瘤的功能状态之间的关系

通过CancerSEA数据库分析了FDX1在COAD单细胞中的表达及其与肿瘤功能状态的关系，发现FDX1在COAD中的表达与 "被遏制 "和 "炎症 "呈明显正相关；相反，FDX1的表达与 "侵袭 "呈负相关（图5）。

2) FDX1表达与免疫细胞浸润之间的关系

通过TIMER2.0分析了FDX1的表达与COAD的免疫浸润之间的关系。结果显示，FDX1的表达与CD8+T细胞、NK细胞和中性粒细胞的浸润水平呈正相关；相反，FDX1的表达与CD4+T细胞和CAFs呈负相关（图6）。

5. 筛选结肠癌中FDX1高表达的患者及其免疫细胞浸润的特点

作者筛选出6名患有结肠癌并且FDX1高表达的患者，Western blot结果显示出FDX1在癌组织中的表达明显高于癌旁组织；通过比较灰度值，癌组织明显高于癌旁组织（图7）。此外，流式细胞仪显示CD8+T细胞在癌组织总淋巴细胞含量也明显高于癌旁组织的。然而，CD4+T细胞在癌症组织中总淋巴细胞的占比明显低于癌旁组织（图8）。验证实验也证实了免疫浸润的结论。