生物基础科研知识点1. 基因组 DNA 提取

 1.1. 酵母、细菌基因组 DNA 提取 

1．1 ml 菌体发酵液，10000rpm 离心 10 min，去上清液； 

2．加 500 uL TE 悬浮沉淀，并加 10-20 uL Lysozyme 混匀，37 度保温 0.5 h； 

3．加 30 uL10%SDS，3 uL 20ug/ml（或 1 mg 干粉）蛋白酶 K，混匀，37 度保温 1 h；

 4．加 100 ul 5 mol/L NaCl 混匀； 

 5．加 8 ul CTAB/NaCl 溶液，混匀，65 度保温 10 min；

6．用等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提，10000rpm 离心 5min，将上清液移至干净离心管中；

7．用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提，10000rpm 离心 5 min，取上清液移至干净离心管中； 

8．加等体积异丙醇，颠倒混合，-20 度静止 20 min，沉淀 DNA，10000rpm 离心 5min；

 9．倒出上清液，DNA 沉淀用 70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于 50 uL TE； 

10．最后贮存液中加入 1 uL RNase。 结果 通常可获得 3-5ugDNA。 

 讨论 

1．在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔夜后没有菌落形成，此时不必急于怀疑实验失败。建议再 倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候，培养皿上会出现菌落。

 2．挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合，则建议重新划板培养， 直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能会给以后的实验带来麻烦。

 3．有关微型离心柱回收的利弊。原理与本实验近似，区别在于在 DNA 的回收阶段，不是采用醋酸钠-乙醇沉 淀，而是采用微型柱。回收产物中往往留有痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续工作困难。  

4．离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离心物和试管，使两侧平衡。 如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同规格的离心管，管内加入与样品数量相等的水。  

5．DNA 的离心通常采用 1.4 万转的转速，10 分钟的时间，这足以满足沉淀 DNA 的要求。

  6．沉淀 DNA 或 RNA 离心时，应把 Eppendorf 管盖的连接蒂指向外侧，以保证离心后沉淀位于管底靠连接蒂 的一侧，当 DNA 或 RNA 量少至难以辨认时，吸取上清之际，可避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。

 7．室温下，DNA 沉淀容易浮起，所以整个操作过程应保持在 4℃环境下进行，手指持试管上部，切勿接触试 管底部。 

8．吸取上清时动作要轻而快，加入 75％乙醇时，应将乙醇沿管壁轻轻加入，以免将沉淀冲起。

 9．通常，实验对 RNA 污染不是有严格要求的话，比如做酶切鉴定的话，实验步骤（加 TE、RNase、NaAC 等）可以免去。这样可以提高实验速度。

 10．离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于离心液表面，为避免大肠杆菌的裂解物堵塞吸头，可以一面 将吸头推出气体，一面插入表面含有大肠杆菌的裂解物的离心液。

11．加入溶液 I 前，可用 200μl 枪头将菌液吸干净。

 12．加入溶液Ⅱ、Ⅲ后，应轻轻颠倒混匀，切忌剧烈震荡混匀，否则容易打断 DNA。

 13．单纯乙醇沉淀效差，可考虑加醋酸钠等盐。加 75％乙醇是为了清洗菌斑，若菌斑中还有无机盐，25％的 水可以把无机盐溶解出来，乙醇可把有机溶剂置换出来。 

  14．65℃水浴时要打开盖子，这样可以使乙醇等挥发掉。

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