无血清条件培养的细胞 注意事项

以HCEC-B4G12人角膜内皮细胞为例：

培养方法

培养条件：Human-Endothelial-SFM，10ng/mL FGF-2b（bFGF）

传代方法：1:3传代；消化2-3分钟。

倍增时间：40-50 hours （DSMZ）

冻存液配方：完全培养基+10% DMSO

培养难点：部分细胞存在空泡，属于细胞正常特性

注意事项

1) 使用配套无血清培养基Human-Endothelial-SFM培养，注意效期。

2) 消化条件：无钙、镁离子的PBS清洗细胞后，使用0.25%胰酶+EDTA消化，具体方法为加1mL胰酶，胰酶润洗细胞表面3-4次后，吸走胰酶，放入37度培养箱消化2分钟。（具体消化时间请在拿到细胞前2次传代时，及时观察，以实际情况为主）

3) 终止消化时，用1mL胰蛋白酶抑制剂（1mg/mL）终止，离心去上清，然后用3mL PBS再次清洗细胞，离心收集后，用新的培养基重悬后铺板。（消化过程中，不要拍瓶身，振荡可促使细胞聚团。）

4) 培养器皿提前使用包被液（10 µg/mL Fibronectin，10 mg/mL 硫酸软骨素）处理，促进细胞贴壁。包被时间至少4小时，建议过夜，室温或37度培养箱包被。可提前包被几个瓶子备用，包被后限一个月内使用。

5) 包被液使用方法：加2-3mL到T25培养瓶或3-4mL到10cm培养皿，放培养箱中，拧上盖子，自然风干。使用时，未风干的包被液枪头吸走即可，然后加1-2mL PBS清洗表面，吸走PBS后即可接种细胞。

参考文献

Valtink, M., Gruschwitz, R., Funk, R. H., & Engelmann, K. (2008). Two clonal cell lines of immortalized human corneal endothelial cells show either differentiated or precursor cell characteristics. Cells, tissues, organs, 187(4), 286–294.

https://doi.org/10.1159/000113406