关于冠状病毒复制—转录复合物相关药物设计的思考

——Structures and functions of coronavirus replication -transcription complexes and their relevance for SARS- CoV-2drug design阅读心得

写在前面

    怎么说呢，这个系列就是把自己的homework拿出来晒一晒，也就是图一乐丢人现眼一下，因为本人能力和知识范围有限，难免会有错误，请谅解一下，也就是仅供参考。引文都有标注，如果有侵权的可以联系我。欢迎各位大佬多交流，提问题、指错误。要是能关注一波那就更好了 ！ 

1 冠状病毒

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），具囊膜（envelope），基因组为线性单股正链的RNA（ssRNA＋）病毒，直径约80-120nm，基因组大小为27-32kb,5'端有帽子，3'端有Poy(A）尾巴。[1]

自2019年COVID-十九大流行以来，针对冠状病毒的药物研究与日俱增。病毒在细胞内的生活历程大致便是复制基因组并表达其蛋白质以制造新的病毒粒子，而冠状病毒相较于其他病毒更依赖于大量RNA复制酶来复制其庞大的基因组，所以其复制转录过程的中心酶—RNA 依赖RNA 聚合酶（RdRP）便是明显的抗病毒药物靶点。[2]

1.1冠状病毒的生活史

冠状病毒的生活史大致可分为四个阶段（如Fig1所示）

（1）进入宿主细胞：SARS的刺突糖蛋白与宿主细胞表面蛋白受体血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，通过被宿主细胞胞吞并膜融合的形成进入宿主细胞，基因组RNA释放到细胞质中，其编码至少13个可识别的开放阅读框（ORF)，在基因组5 '端到3 '端上线性排列，gRNA的编码部分两侧各有一个非编码区（如Fig2所示）。

（2）RNA复制的准备：SARS- CoV-2 gRNA在细胞质中首先招募宿主核糖体，并率先进行复制酶ORF1a和ORF1b的翻译过程，由此得到氨基末端共线复制酶多蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab经过多种蛋白酶水解后，释放出16个成熟的非结构蛋白（nonstructural，nsp）。pp1a生成nsp1到nsp11，而pp1ab则被切割成nsp1到nsp10, nsp12到nsp16。快速释放的nsp1介导宿主mRNAs翻译的关闭，而其他非结构蛋白形成蛋白质复合物（尚未明确确定），参与病毒RNA合成，被称为复制－转录复合物（replication–transcription complexes，RTC)，其中nsp12含有RdRp结构域，在nsp7和nsp8的协助下催化RNA合成，共同形成全酶RdRp (holo- RdRp)，其他RTC亚基在RTC中起辅助作用，调节宿主的先天免疫反应或将细胞膜改造成称为“复制细胞器”的特殊双膜结构，以适应病毒RNA合成。

（3）RNA的复制：通过RTC的作用，生成全长的反义负链模板，从负链亚基因组模板中合成亚基因组mRNAs，亚基因组mRNAs的翻译会产生病毒的结构蛋白

（4）病毒粒子的组装：病毒粒子在内质网中组装，并通过溶酶体运送到细胞外。[2-3]

1.2冠状病毒的相关复制—转录复合物

冠状病毒的复制——转录复合物（RTC）由其核心的RdRp 全酶（holo-RdRp，包括nsp7/nsp82/nsp12）及其他辅助nsp蛋白构成并共同发挥作用（如Fig 3），合成所有病毒RNA分子。RdRp是瑞德西韦等抗病毒药物的靶点。除了在病毒基因组的复制和转录中发挥核心作用外，RdRp还包含一个N端套式病毒RdRp相关的核苷酸转移酶（nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase, NiRAN）结构域，这个结构域功能未知，但具有对病毒传播必不可少的酶活性。

 holo-RdRp被认为在病毒生命周期中与一些辅助因子进行协调。这些辅助因子之一是nsp13，它是一种以NTP依赖的方式以5'->3'极性解开DNA或RNA的超家族1B（SF1B）螺旋酶。这种螺旋酶对于套式病毒马动脉炎病毒（equine arteritis virus, EAV）和β冠状病毒小鼠肝炎病毒的复制是必不可少的，并被推测在所有套式病毒中都是必不可少的。这种螺旋酶被认为在病毒生命周期的许多方面发挥着关键作用。[2][4]

2 冠状病毒的药物设计

尽管针对SARS- CoV-2的疫苗已经显示出显著的疗效，但COVID-19仍在继续传播并影响全球社区。为了避免新冠病毒的不断演化导致疫苗效率降低等负面影响，寻找抵抗SARS- CoV-2及相关病毒的药物仍然是研究界的优先事项。而目前主要有三种研发新药的策略。

第一种策略是测试已有的广谱抗病毒药物。过去用于治疗冠状病毒肺炎的干扰素、利巴韦林、以及亲环蛋白抑制剂（cyclophilin inhibitors）。这些疗法的优点在于早已获批上市，治疗不同的病毒感染，因此其在人体内的代谢特征，使用的剂量，潜在的疗效和副作用都很明确。但缺点在于这些疗法过于“广谱”，不能针对性地治疗冠状病毒。

第二种策略是利用已有的分子库和数据库，筛选可能对冠状病毒有治疗效果的分子。这种策略能够在很短的时间内进行高通量的筛选，也能够测试许多原本不会被考虑到的药物分子，但尽管许多药物在体外展现出了良好的抗冠状病毒活性，却往往不具有人体内应用的价值。一方面是因为可能会带来免疫力抑制的副作用，另一方面则是因为药物起效所需的浓度，往往会超过血清药物浓度的上限。

第三种策略最为直接，根据不同冠状病毒的基因组信息和病理特点，有从头开发新药。例如最近美国批准上市的核苷酸类似物remdesivir和molnupiravir就可以靶向RdRp，Remdesivir在冠状病毒RNA的复制过程中会模拟ATP进入复制机器RdRp中，卡在RdRp和模板RNA之间，导致RNA的合成终止，达到抑制病毒复制的目的。而Molnupiravir的结构比较灵活，在新冠病毒的合成过程中，它能模拟CTP和UTP插入到新冠病毒的RNA中，导致“致命诱变”，实现抑制新冠病毒的复制增殖的目的。理论上说，这些疗法的抗冠状病毒效果会更胜一筹，但它需要验证不同药物在人体中的代谢情况和副作用，也需要依次开展动物和人类的临床试验，观察是否安全有效，从研发到上市的时间跨度太长。[2][6][7]

3 思考与展望

  在全球疫情大流行的当下，针对SARS-COV-2的研究刻不容缓，哪怕如今毒株的严重性与致死性已经有了明显的下降，我们也无法忽视凭借RNA病毒极快的变异速率，会在什么时候导致致病性与致死性再度回升，导致疫苗的预防效果下降，只有彻底地解析了解病毒生活史的方方面面，了解其蛋白组的详细信息，摸清病毒的保守部分，我们才能更好地针对性研发出可以长期使用药物。

但新型药物药研发存在的种种瓶颈仍然困扰着我们，例如缺乏合适的动物模型、病毒的突变性和多样性使得部分新药物失灵，临床试验缺乏患者等。这些问题需要科学家、政府以及每一位普通人的努力，这场席卷全球的瘟疫才会逐渐平息。

参考文献：

[1] 黄保洋，张欢，曹玟瑾，李甜，王炳辉.冠状病毒特征与进化优势[J/OL].中国医学科学院学1-7[2022-12-14].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2237.R.20221114.0939.022.html

[2] Malone B, Urakova N, Snijder EJ, Campbell EA. Structures and functions of coronavirus replication-transcription complexes and their relevance for SARS-CoV-2 drug design. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022 Jan;23(1):21-39. doi: 10.1038/s41580-021-00432-z. Epub 2021 Nov 25. PMID: 34824452; PMCID: PMC8613731.

[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/107320312

[4] Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, Maruthi K, Eng ET, Vatandaslar H, Chait BT, Kapoor TM, Darst SA, Campbell EA. Structural Basis for Helicase-Polymerase Coupling in the SARS-CoV-2 Replication-Transcription Complex. Cell. 2020 Sep 17;182(6):1560-1573.e13. doi: 10.1016/j.cell.2020.07.033. Epub 2020 Jul 28. PMID: 32783916; PMCID: PMC7386476.

[5] Yan L, Ge J, Zheng L, Zhang Y, Gao Y, Wang T, Huang Y, Yang Y, Gao S, Li M, Liu Z, Wang H, Li Y, Chen Y, Guddat LW, Wang Q, Rao Z, Lou Z. Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis. Cell. 2021 Jan 7;184(1):184-193.e10. doi: 10.1016/j.cell.2020.11.016. Epub 2020 Nov 14. PMID: 33232691; PMCID: PMC7666536.

[6] Zumla A, Chan JF, Azhar EI, Hui DS, Yuen KY. Coronaviruses - drug discovery and therapeutic options. Nat Rev Drug Discov. 2016 May;15(5):327-47. doi: 10.1038/nrd.2015.37. Epub 2016 Feb 12. PMID: 26868298; PMCID: PMC7097181.

[7] https://new.qq.com/rain/a/20200126A03NGF00