Biomaterials：脊髓样组织移植结合尾神经电刺激促进SCI后运动功能
众所周知，横断脊髓损伤 (SCI) 可能导致损伤下方脊髓的神经支配丧失、神经功能性沉默。已有研究证明，对 SCI 大鼠进行调制中频尾神经电刺激 (TNES) 可有效保护受损的 L1-L5 脊髓神经元，并防止后肢肌肉萎缩。然而，与没有任何干预的 SCI 大鼠相比，TNES 后 SCI（E-SCI）大鼠的运动功能没有显著恢复，这可能与脑源性神经信号向 SCI 部位以下的脊髓神经元传递效率较低有关。
然而，目前仍然严重缺乏在 SCI 部位诱导干细胞分化成神经元或髓鞘细胞的合适方法，且针对TNES相关神经回路及其机制的研究相对较少。
为解决此类问题, 2023年3月，中山大学医学院组织胚胎系曾园山实验室在Biomaterials上发表文章，他们探讨了 SCLT 移植联合 TNES （E-SCLT）是否可以促进神经回路的修复和功能激活，并揭示这些方法协同促进自主运动恢复的机制。
文章主要内容：
1构建SCLT神经元
通过基因修饰和3D培养技术，研究者构建出白质样组织和灰质样组织，将两种组织进行共培养后构建出SCLT 神经元。研究人员用各种方法验证了SCLT 神经元的功能的完整性：包括高表达的突触标志蛋白PSD95和SYP；电子显微镜显示SCLT 神经元在14天时已与邻近细胞接触，并建立了突触连接；观察到成熟突触的特征，包括轴突末端的突触小泡、突触后致密物的形成和膜增厚。通过全细胞记录动作电位和突触传递，研究者记录到用两种不同电流注射诱导的动作电位，检测到微小兴奋性、抑制性突触后电流（mEPSCs、mIPSCs），表明分化的 SCLT 神经元成熟，形成兴奋--抑制神经网络。
为了可视化 SCLT 中谷氨酸的动态释放，研究人员还利用用谷氨酸传感器 iGluSnFR 技术，证明高钾刺激能够诱发SCLT 中的谷氨酸释放（图1）。
图1：SCLT模拟脊髓组织的构建
2行为学验证SCLT移植结合TNES治疗能够改善运动功能
在大鼠T10处，从完全脊髓横断部位切除2mm脊髓，导致其后肢完全瘫痪。然后将SCLT移植到受伤造成的间隙内，在手术和移植后8天开始TNES治疗，每周进行5次，持续8周。单独接受 TNES （E-SCI）和同时进行SCLT 植入物的大鼠（E-SCLT）都表现出了明显的后肢反射。此外，E-SCLT组表现出了最强的放置反射，E-SCLT 组中的大鼠在静止姿势期间用后肢支撑体重，表明当用 TNES 和 SCLT 的组合治疗大鼠时，可以保留更多的肌肉力量。
此外，研究者观察到接受 TNES 8 周的大鼠腓肠肌和胫骨前肌萎缩较少。经过治疗的大鼠可以通过后肢重量支撑移动三个关节，表明 TNES 是缓解 SCI 后后肢肌肉萎缩的潜在策略（图2）。
图2: 行为、肌肉湿重和电生理结果的分析
3 SCLT移植结合TNES治疗在组织学上的改善
研究者发现移植的SCLT与脊髓结合良好，植入物和宿主组织之间没有间隙。与 SCLT 组相比，E-SCLT 组中更多的神经纤维被 MBP+ 细胞包裹。E-SCI 组进行 TNES 治疗后，损伤部位的神经纤维生长和髓鞘形成均得到改善。
为了进一步确定 TNES 对腰椎脊髓神经元的影响，研究者比较了 SCLT 和 E-SCLT 组腰椎脊髓神经元激活相关蛋白的表达。结果显示，活动调节的细胞骨架相关蛋白（Arc，神经元突触可塑性的标志物）均匀分布在脊髓前角和后角。与 SCLT 组相比，E-SCLT 组脊髓 L2 和 L5 节段的 Arc 表达更高。c-Fos在 E-SCLT 组的脊髓 L2 和 L5 节段中高水平表达，但在SCLT 组中未检测到。
此外，因为兴奋性神经传递与运动功能有关，研究者用免疫细胞化学染色分析了谷氨酰胺能神经纤维的变化，结果显示：与SCI组相比，E-SCI、SCLT和E-SCLT组尾部损伤/移植部位的VGluT1+神经纤维更多。虽然在 SCLT 和 E-SCLT 组的损伤/移植部位的延髓区域检测到的 VGluT1+ 神经纤维数量没有统计学差异，然而，它们的数量明显多于 SCI 和 E-SCI 组，表明SCLT 移植联合 TNES 可促进受损脊髓中 VGluT1+ 神经纤维的再生。
最后，研究者利用蛋白质印迹测试了SCI后瘫痪后肢的肌肉神经支配和氧化能力，E-SCLT组同样在这些方面显示出较强能力。
4 脊髓损伤神经元连接的逆行神经通路追踪与分析
为确定 TNES 对控制后肢行为的下胸腰段脊髓神经元和损伤/移植部位传输神经信息的供体神经元影响，研究者将逆行示踪剂 FG 注射到坐骨神经，PRV注射到尾神经。结果显示，腰骶脊髓前角运动神经元与 CPG 神经元形成神经回路。在 L4节段，一些运动神经元分别与来自后肢和尾部的 FG 和 PRV 共同标记，而其他运动神经元仅被FG 标记。
为了确定从尾神经接收电刺激的传入通路，研究者将非跨突触霍乱毒素 B (CTB) 注射到大鼠尾部，结果在 L2 段的背角中观察到一些CTB+ 神经纤维，并与EPHA4+/VGluT2+神经元形成接触，表明尾部确实能够接收到电刺激（图3）。
图3: E-SCLT组胸腰椎下脊髓逆行追踪神经元连接
5总结
在本文中，研究者构建了 SCI 大鼠模型，建立了神经干细胞衍生的脊髓样组织 (SCLT)，并评估其作为神经元替代损伤脊髓和修复脊髓神经传导的能力。同时结合电刺激尾神经 (TNES) 进一步激活腰骶脊髓，以更好接收 SCLT 传输的神经信息。SCLT 和 TNES 的结合有望为 SCI 患者恢复自主运动和控制肌肉提供新的突破。
参考文献：
Lai, Bi-Qin et al. “Tail nerve electrical stimulation promoted the efficiency of transplanted spinal cord-like tissue as a neuronal relay to repair the motor function of rats with transected spinal cord injury.” Biomaterials, vol. 297 122103. 28 Mar. 2023, doi:10.1016/j.biomaterials.2023.122103
文献链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961223001114
编译作者：brainnews创作团队
