如何从总RNA中分离mRNA

总RNA的组成是什么？

RNA分离的结果称为总RNA。它由细胞产生的所有三种主要类型的RNA组成。它们是mRNA，tRNA和rRNA。tRNA和rRNA都有助于翻译。真核mRNA的大小为0.5-20 kb。转移RNA（tRNA）在翻译过程中带来相应的氨基酸。它有76-90个碱基对长，由反密码子区域组成，反密码子区域与mRNA上的特定密码子互补。核糖体RNA（rRNA）是核糖体的一种成分。一些人类rRNA长5kb。

超过90%的总RNA由tRNA和rRNA组成。总RNA中只有1-5%是mRNA。一个典型的哺乳动物细胞每个细胞可能由大约500，000个mRNA分子组成。特定类型的mRNA的量可以是每个细胞15-20，000拷贝。

图1.mRNA结构

如何从总RNA中分离mRNA

多项分子生物学技术，如cDNA文库构建、微阵列制备样品制备、弱表达基因的北方印迹分析等。需要高质量的mRNA。根据细胞类型，从总RNA中分离mRNA有两种主要方法：直接分离mRNA的方法和减法分离mRNA方法。

mRNA分离的直接方法

从真核总RNA中分离成熟mRNA的原理涉及使用寡核苷酸dT（寡聚糖胸苷酸）对聚腺苷酸mRNA进行亲和选择/亲和色谱，寡核苷酸与poly（A）尾部互补。这是由于另外两种类型的RNA中没有poly（A）尾巴：tRNA和rRNA。

mRNA由30-200个腺嘌呤核苷酸组成。填充寡核苷酸dT/载体组合的亲和柱用于从总RNA中分离mRNA。寡核苷酸dT/载体组合可以是纤维素结合的寡核苷酸dT、具有链霉亲和素偶联磁珠的生物素化寡核苷酸dT或寡核苷酸dT偶联聚苯乙烯-乳胶珠。所有实验条件都应处于无RNase的条件下，以防止RNA的酶分解。

图2：亲和色谱

总RNA应溶解在高盐缓冲液中，并短暂加热至65-70°C以破坏RNA的二级结构。RNA分离的条件因市售的mRNA分离试剂盒而异。然而，聚（A）-RNA或mRNA的制备由三个步骤组成。

1. 聚（A）-RNA与连接到载体的寡核苷酸dT分子的杂交

2. 洗掉未结合的RNA

3. 在低严格条件下从寡核苷酸-dT/载体组合中洗脱聚（A）-RNA

mRNA减法分离

基于寡核苷酸dT的mRNA纯化仅产生具有poly（A）尾部或成熟真核mRNA的mRNA。因此，另一种称为减法的方法可用于纯化没有poly（A）尾巴的mRNA。该方法可用于从酵母和细菌总RNA中分离mRNA。它还可用于从真核细胞中分离未成熟类型的mRNA以及成熟的mRNA。它涉及通过从总RNA中消耗大核糖体RNA来富集转录组。

1. 总RNA与rRNA序列特异性5′生物素标记寡核苷酸探针的杂交

2. 去除rRNA/5′-生物素标记的探针复合物以及链霉亲和素包被的磁珠

3. 杂质纯化和mRNA洗脱。