自噬研究指南|干货篇：自噬检测方法详解
上期介绍了自噬的定义、过程和研究意义，要理解自噬生物学意义和潜在机制，检测自噬活性至关重要。如何研究自噬，常用的自噬检测方法有哪些，这些问题将在本期一一解答。
1. 自噬研究经典思路
一个清晰的研究思路是做研究的第一步，也是非常关键的一环，明确研究思路之后设计实验方案或是查找参考文献才能事半功倍，自噬研究的常用思路可参考下图。
2. 自噬检测方法
根据研究思路确定实验方案之后，自然是要选择合适的研究工具。目前，检测自噬水平的方法主要有三种：电镜观察、WB检测和荧光蛋白标记检测。接下来将对这三种方法做详细介绍。
2.1透射电镜
自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，可使用透射电镜可直接观察自噬不同阶段的形态变化，以初步判断自噬阶段（见表1），但无法进行定量检测。
表1 自噬标志及其形态特征
2.2 WB检测标志物
检测与自噬小体膜结合的自噬体蛋白Atg8及其同源物的表达水平也是常用的自噬检测方法。Atg8中，LC3B（通常简称为LC3）最先被发现并被广泛使用。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此可利用WB检测LC3-II/I比值的变化以评估自噬的强弱。此外自噬衔接物如sequestosome 1（SQSTM1，也称为p62）也可用于检测自噬，p62蛋白水平的多少与自噬强弱有着反比例关系。
2.3荧光蛋白标记检测
2.3.1 GFP-LC3
利用绿色荧光蛋白（GFP）在酸性环境中淬灭的特性，研究人员开发出了GFP-LC3工具检测自噬，可使用流式细胞仪定量检测，但使用荧光显微镜检测效果不够理想。
2.3.2 RFP-GFP-LC3
在GFP-LC3的基础上，研究人员开发了GFP-RFP-LC3工具，红色荧光蛋白（RFP）在酸性环境中信号稳定。报告基因发出红色和绿色的荧光，图像重合时，自噬体将显示黄光。然而，在自噬溶酶体的酸性环境中，GFP荧光迅速淬灭，只留下红色荧光信号。诱导自噬后，黄光（表示更多的自噬体）和红光（表示更多的自噬体）增加。然而，当自噬流由于溶酶体抑制而减少时，黄光占比较高，这表明自噬体-溶酶体融合和/或在自噬溶酶体内降解减少。当自噬诱导受到抑制时，黄光和红光均减少。
2.3.3 GFP-LC3-RFP(-LC3ΔG)
细胞内表达的GFP-LC3-RFP-LC3ΔG融合蛋白经Atg4内肽酶加工，断裂成GFP-LC3和RFP-LC3ΔG，后者缺乏与膜结合所需的C末端甘氨酸。GFP-LC3和RFP-LC3ΔG分别充当自噬底物和内对照。GFP-LC3相对于RFP-LC3ΔG的比值与自噬强弱呈负相关。这种方法可以使用流式细胞仪或荧光酶标仪检测自噬。
2.3.4 Keima
Keima是一种独特的荧光蛋白，在中性和酸性条件下分别在440 nm和550 nm处有两个激发峰，在620 nm处有一个发射峰，这一特性使我们能够监测Keima从细胞质到溶酶体的递送。由于这是一种不依赖于Atg8的方法，Keima适用于监测大量（非选择性）自噬和小自噬，若Keima与细胞器标记物融合，也可用于检测细胞器自噬。
表2 不同自噬检测方法的原理和优缺点
本期主要介绍了自噬检测方法，并对各个检测方法的优缺点进行了总结（见表2），实验中需根据实验目的选择合适的方法。汉恒生物研发了多种LC3标记的病毒，如GFP-LC3、RFP-GFP-LC3等，不仅可提供用于细胞实验的慢病毒和腺病毒，还可提供用于动物实验的腺相关病毒。更多关于自噬检测的问题，欢迎咨询汉恒生物！
参考文献：
[1]Mizushima, Noboru., Murphy, Leon O.. Autophagy Assays for Biological Discovery and Therapeutic Development. Trends in biochemical sciences, 2020, 45(12):1080-1093.
